Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşim Çalışmaları İçin Modifiye Maya-Bir Hibrid Sistem
Summary
Burada açıklanan tadil edilmiş maya tek hibrid tahlil, herhangi bir işlevsel genomik çalışma için heterolog bir sistemde heteromerik protein kompleksi-DNA etkileşimini incelemek ve doğrulamak için klasik maya tek hibrid (Y1H) analizinin bir uzantısıdır.
Abstract
Yıllar boyunca, maya tek hibrid tahlili, transkripsiyon faktörleri (TF'ler) ve DNA hedefleri gibi proteinler arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlamak ve doğrulamak için önemli bir teknik olduğu kanıtlanmıştır. Burada sunulan yöntem Y1H'nin altında yatan kavramı kullanır, ancak hedef DNA'sına bağlanan protein komplekslerini incelemek ve doğrulamak için daha da modifiye edilir. Bu nedenle modifiye edilmiş maya tek hibrid (Y1.5H) tahlili olarak geçmektedir. Bu test maliyet açısından etkili olup, düzenli bir laboratuar ortamında kolayca uygulanabilir. Her ne kadar heterolog bir sistem kullansa da , tarif edilen yöntem, herhangi bir çalışma sisteminde, özellikle bitki genomiği için işlevsel genomik için DNA hedeflerine / hücrelerine bağlanan heteromerik protein kompleksini test etmek ve doğrulamak için değerli bir araç olabilir.
Introduction
Genel olarak, protein-DNA etkileşimlerini anlamak için Y1H tahlili, laboratuar ortamında başarıyla kullanılan tercih edilen sistemdir 1 . Temel Y1H tahlili iki bileşen içerir: a) bir raportör proteini şifreleyen bir genin üst akışına başarıyla klonlanmış ilgi DNA'sı olan bir raportör yapı; Ve b) ilgili TF ile bir maya transkripsiyon aktivasyon alanı (AD) arasında bir füzyon proteini üretecek bir ifade konstrüksiyonu. Fusion protein "av" olarak bilinirken ilgi DNA, yaygın olarak 'yem' olarak anılır. Geçmiş yıllarda, Y1H tahlilinin birden fazla versiyonu, kendi avantajları ile spesifik ihtiyaçlara göre geliştirilmiştir 2 . Mevcut Y1H tahlili, DNA yemiyle bir defada bir proteinin etkileşimini tanımlamak ve doğrulamak için başarılı bir şekilde uygulanabilir ancak heterodimerik veya multimerik protein-DNA etkileşimlerini tanımlama yeteneğinden yoksundur.
"> Burada açıklanan yöntem, mevcut Y1H'nin değiştirilmiş bir versiyonudur ve araştırmacıların hedef DNA dizilimine / proteinlerine aynı anda birden çok protein bağlamalarını sağlar Bu tahlilin amacı, bir etkinleştirme domeniyle ilgilenilen proteini (pDEST22: TF) ve maya sisteminde etkileşen protein partnerinin (pDEST32ΔDBD-TF) varlığında ve / veya yokluğunda bir haberci ile birleştirilen aday DNA bölgelerinin aktivasyonunu değerlendirin.Bu tahlilde bu iki Proteinlerin, hedefin aktivasyonu için gereklidir.Bu, bir GATEWAY klonlama uyumlu sistemidir ve bu nedenle, düzenli bir laboratuar ortamında kullanılmak üzere uygundur.Bu protokol, bir maya sistemindeki farklı TF'lerin birlikte dönüştürülmesini kolaylaştıran doğrudan dönüşüme dayanır Dolayısıyla, in vitro moleküler ve fonksiyonel doğrulama için olası DNA hedeflerine bağlanan protein komplekslerini doğrulamak için avantajlı bir strateji fVeya herhangi bir sistem. Tandem afiniteli saflaştırma (TAP) yöntemleri gibi mevcut teknikler maliyetli ve emek gerektirir, ancak protein hetro-komplekslerinin büyük ölçekte saptanmasına izin verir 3 , 4 , 5 . Bu modifiye maya tek hibridi, küçük bir ölçekte ( Şekil 1 ) düzenli bir laboratuar ortamında başarıyla uygulanabilir ve aynı zamanda maliyet açısından da etkili olur. Y1.5H tahlili, heterolog bir sistem kullanarak ortak bir DNA hedefine bağlanan multimerik protein kompleksinin rolünü tanımlamaya yönelik hipotezlerini test etmek ve doğrulamak için toplumdaki araştırmacıları kolaylaştırabilir. Bulgulara dayanarak, hipotez, tercih edilen çalışma sisteminde in vivo olarak doğrulanabilir. Son zamanlarda, Arabidopsis 6'da çiçek açmayı düzenleyen bir TF'nin rolünü ve bunun hareket biçimini tanımlamak için bu yaklaşımı kullandık.Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut Y1H standart prosedürü, DNA yemine bağlanan tek bir protein yırtıcıyı tanımlamak için uygundur. Çeşitli teknik değişikliklerle, mevcut sistem transkripsiyonel düzenleyici ağları tanımlamak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, TF'lerin, iki veya daha fazla TF veya protein içeren komplekslerin bir parçası olarak işlev gördüğü ve bunların sadece bir kısmının DNA'ya bağlanabildiği bilinmektedir. Sadece protein bağlama alanlarına sahip olan ve DNA'ya bağlanma yetene…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazının eleştirel okunması için SS Wang, M. Amar ve A. Galla'ya teşekkür ediyoruz. Bu yayında bildirilen araştırmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından RO1GM067837 ve RO1GM056006 (SAK'a) ödül numaraları ile desteklenmiştir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmez.
Materials
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Strain | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER One-Hybrid System |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| GATEWAY LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD minimal media | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 well round bottom Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Sealable Foil | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Plate Reader | Molecular Device | SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer | |
| Incubator | Thermo Fisher | Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees | |
| Shaker Incubator | New Brunswick | ||
| Water Bath | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
References
- Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
- Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Gavin, A. -. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
- Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
- Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
- Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
- Klein, P., Dietz, K. -. J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
- Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome. Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).
- Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens. CSH Protoc. 2006 (5), (2006).
- Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. A gateway-compatible yeast one-hybrid system. Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).
