Summary

Высоким содержанием жиров питание и высокая пропускная способность Triacylglyceride Assay в Drosophila Melanogaster

Published: September 13, 2017
doi:

Summary

Это высокий жира диета питание протокол побудить ожирения у дрозофилы, модель для понимания основополагающих молекулярных механизмов, причастных к lipotoxicity. Она также обеспечивает Пробирная triacylglyceride высокой пропускной способности для измерения накопление жира в дрозофилы и потенциально другие (насекомое) модели различных диетических, экологических, генетических или физиологических условиях.

Abstract

Болезнь сердца является номер один причиной смерти человека во всем мире. Многочисленные исследования показали прочные связи между ожирением и сердечной неисправности в организме человека, но больше инструментов и исследовательские усилия необходимы для лучшего выяснения механизмов. Для более века, генетически очень шансов справиться с возникающими модель дрозофилы сыграла важную роль в открытие ключевых генов и молекулярные пути, которые оказались весьма сохраняться различных видов. Многие биологические процессы и механизмы болезней функционально консервируют в лету, как развитие (например, план тела, сердца), рак и нейродегенеративных заболеваний. Недавно изучению ожирения и вторичные патологий, таких как болезни сердца в модельных организмов, играет весьма важную роль в выявлении ключевых регуляторов участвующих в метаболического синдрома в организме человека.

Здесь мы предлагаем использовать эту модель организма как эффективный инструмент чтобы вызвать ожирение, то есть, чрезмерное накопление жира и разработать эффективный протокол контролировать содержание жира в виде тегов накопления. В дополнение к весьма сохраняется, но менее сложных генома лету также имеет короткий срок для быстрого экспериментов, в сочетании с экономической эффективности. Этот документ предоставляет подробный протокол для высоких жиров диеты (HFD) кормления у дрозофилы побудить ожирения и высокая пропускная способность assay triacylglyceride (TAG) для измерения связанное с этим увеличение содержание жира, с тем чтобы быть высокую воспроизводимость и эффективно для крупномасштабных генетических или химического скрининга. Эти протоколы предлагают новые возможности эффективно расследовать регламентационных механизмов, участвующих в ожирения, а также предоставляют стандартизированную платформу для исследования обнаружения наркотиков для быстрого тестирования воздействия наркотиков кандидатов на развитие или Профилактика ожирения, диабета и связанных с ними метаболических заболеваний.

Introduction

Мы находимся в то время где ожирения и ее ассоциированные экономические трудности, является общемировой проблемой1. Два из каждых трех американцев, избыточный вес или страдают ожирением с связанные сердца патологий, основной причиной смерти в течение взрослого населения2. Новые эффективные методы необходимо адекватно расследовать генетические и молекулярные компоненты, замешанных в регуляции метаболического синдрома с помощью модельных организмов. По этой причине мы выбираем модель плодовой мушки Drosophila потому, что он разделяет самых основных биологических процессов с млекопитающих, в том числе мышей и людей3,4,5,6. Геном дрозофилывысоко сохраняется в ходе эволюции, но в целом гораздо меньше с меньше гена дублирования и метаболических сложности, что делает его идеальным для понимания основных механизмов, причастных к многих заболеваний человека4 , 7 , 8. Кроме того, характерные процессы, проведенного жировой ткани, кишечника и поджелудочной железы представлены в лету и посредником функции регулирования в метаболизм глюкозы и липидов, например, которые похожи на людей9, 10,11. Кроме того основные молекулярные пути, участвующие в элементе управления, ожирение, инсулинорезистентность и диабета в организме человека функционально сохраняются в Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. как высших организмов, дрозофила имеет бьющееся сердце, которая образуется в процессе разработки аналогичных процессов,3,млекопитающих сердце17. Таким образом развитие надежной HFD кормления протокол и высокая пропускная способность тег assay, адаптированы для целей эффективного отбора с помощью окна генетических инструмент дрозофилы, обеспечивают важным средством для изучения и понимания генетической основой Базовый комплекс метаболических заболеваний.

HFD еда сама изготавливается из Стандартный лабораторный летать еда дополнена кокосовое масло, которое состоит в основном из насыщенных жирных кислот, известный ассоциироваться с метаболическим синдромом18. В то время как заставить ожирения у млекопитающих моделей, таких как грызуны, может занять месяцы19,20, наши оптимизированные HFD кормления протокол у дрозофилы , можно воспроизвести и эффективно увеличивает научные содержание жира в считанные дни12,14. Этот протокол, в сочетании с высокой пропускной способностью тег assay, позволяет эффективного массового скрининга для эффектов генетических факторов, влияние окружающей среды и наркотиков кандидатов, чтобы обнаружить новые модуляторы жирового обмена. Как следствие, эти протоколы являются скорее всего отношение к понимать и/или борьбы с ожирением и ожирение связанные человеческих патологий.

Кормления протокол универсален и может применяться для изучения метаболизма и функциональных последствий одного насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты. Использование этот assay тег высокой пропускной способности не ограничивается D. melanogaster, но могут быть адаптированы к различным маленькая модель организмов с кутикулы или жесткой внеклеточной матрицы (например, другие Drosophila видов, C. elegans и другие новые модели беспозвоночных организмов) для измерения содержания жира в различных экологических, генетических и физиологических условиях, на любой стадии развития, зрелости или фазы метаболических заболеваний. TAG assay основан на колориметрические измерения ряда ферментативных реакций, которые деградируют теги в свободных жирных кислот, глицерина, глицерин-3-фосфат и, наконец, H2O2 , который реагирует с 4-аминоантипирина (4-АПУ) и 3,5- дихлор-2-гидроксибензол сульфонат (3,5 Омск) производить красный цветной продукт, который измеряется с помощью 96-луночных спектрофотометром.

Protocol

1. HFD кормления протокол в таблице 1. Fly питания рецепт. В следующей таблице перечислены различные ингредиенты, используемые для подготовки нашего управления питания. После того, как сделал, 10 мл пищи выливают в флаконах, ?…

Representative Results

D. melanogasterкак в случае с другими видами, в половой диморфизм между22мужчины и женщины. Хорошо известно, что самки крупнее, с больше жира в их животы, чем мужчины22. Чтобы проверить эффективность нашего протокола, мы провели тег анализов для оп?…

Discussion

Индукции ожирением мышей может занять месяцы19,20. В мух этот HFD кормления протокол позволяет для индукции избыточное накопление жира в течение нескольких дней или меньше, вызывая увеличение в накопление жира только после 18 h (см. Рисунок 2). H…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Erika Тейлор для редактирования этой рукописи. Эта работа финансировалась грантов от национальных институтов здравоохранения (P01 HL098053, P01 AG033561 и R01 HL054732) для р.б., добавки пост-докторские исследования (R01 HL085481) и стипендий (AAUW) к S.B.D. и гранты от Американской ассоциации сердца в S.B.D. и R.T.B.

Materials

Talboys Ball dropper/bead Dispenser Talboys #: 930150
Talboys High Throughput Homogenizer Talboys #: 930145
Grinding Balls, Stainless Steel  OPS Diagnostics, LLC # GBSS 156-5000-01 5000 balls
Masterblock 96 Well deep Microplates Greiner Bio-One # T-3058-1 case of 80 plates
Greiner  96 well microplate flat bottom Sigma Aldrich # M4436 40 plates
Greiner CapMat for sealing multiwell plates Sigma Aldrich # C3606 50 sealing plates
Reagent Reservoirs  Thomas Scientific # 1192T71 12/PK
Thermo Scientific Finnpipette 4661040 Thermo Scientific # 4661040 1-10 ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661070 Thermo Scientific # 4661070 30-300ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661020 Thermo Scientific #4661020 10-100ul multipipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc # P3131-S for 10 uL pipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc # P3133-S for 200 uL pipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc #P1125 for 100 uL pipette
Forceps  Roboz Surgical # 5 Dumonts Super fine forceps
Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 Cole-Parmer scientific experts # EW-11333-00
Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance Cole-Parmer scientific experts # EW-11333-49
96-Well microplate Centrifuge Hettich Zentrifugen # Rotina 420R
Microplate Reader Molecular devices # SpectraMax 190
Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator Biostad # 3527
Infinity Triglycerides reagent Thermo Scientific # TR22421
Triglyceride Standard Stanbio #2103 – 030
Quick Start Bradford Protein Assay Bio-RAD # 500-0205 1x dye Reagent
Coconut oil Nutiva # 692752200014 15 0z jar
PBS 10X Thermo Scientific # AM9625 500 ml
Triton X-100 Sigma Aldrich # 9002-93-1
Gas-permeable Foil Macherey-Nagel # 740675 50 pieces
filter Paper VWR # 28317-241 Pack of 100
Drosophila vials Genesee Scientific Cat #: 32-116SB
Quick Start Bovine Serum Albumin Standard Bio-Rad # 5000206
FlyNap Anesthetic Carolina # 173025 100 mL
Kimwipes Low-Lint Uline # S-8115 1-Ply, 4.4 x 8.4"

References

  1. Ng, M., et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 384, 766-781 (2014).
  2. Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229 Available from: https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm (2015)
  3. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).
  4. Brumby, A. M., Richardson, H. E. Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways. Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).
  5. Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).
  6. Levine, M., et al. Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila. Cell. 38, 667-673 (1984).
  7. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
  8. Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
  9. Noyes, B. E., et al. Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene. Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).
  10. Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biol. 11, 38 (2013).
  11. Rulifson, E. J., et al. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1120 (2002).
  12. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12, 533-544 (2010).
  13. Musselman, L. P., et al. A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila. Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).
  14. Diop, S. B., Bodmer, R. Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila. Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).
  15. Williams, M. J., et al. The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling. Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).
  16. Morris, S. N., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).
  17. Bodmer, R. The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila. Development. 118, 719-729 (1993).
  18. Erkkila, A., et al. Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach. Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).
  19. Ganz, M., et al. High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation. World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).
  20. Wang, C. Y., Liao, J. K. A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance. Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).
  21. Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).
  22. Mathews, K. W., et al. Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila. Genetics. 205, 1215-1228 (2017).
  23. Golay, A., Bobbioni, E. The role of dietary fat in obesity. Int J Obes Relat Metab Disord. 21, 2-11 (1997).
  24. Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Rep. 10, 1-13 (2015).
  25. Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).
  26. Palanker, L., et al. Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation. Cell Metab. 9, 228-239 (2009).
  27. Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. Role of high-fat diet in stress response of Drosophila. PLoS One. 7, 42587 (2012).
  28. Kitahara, C. M., et al. Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies. PLoS Med. 11, 1001673 (2014).
  29. Reis, A., et al. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).
  30. Turne, C., et al. Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis. J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).
  31. Na, J., et al. Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy. PLoS Genet. 9, 1003175 (2013).

Play Video

Cite This Article
Diop, S. B., Birse, R. T., Bodmer, R. High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (127), e56029, doi:10.3791/56029 (2017).

View Video