Это высокий жира диета питание протокол побудить ожирения у дрозофилы, модель для понимания основополагающих молекулярных механизмов, причастных к lipotoxicity. Она также обеспечивает Пробирная triacylglyceride высокой пропускной способности для измерения накопление жира в дрозофилы и потенциально другие (насекомое) модели различных диетических, экологических, генетических или физиологических условиях.
Болезнь сердца является номер один причиной смерти человека во всем мире. Многочисленные исследования показали прочные связи между ожирением и сердечной неисправности в организме человека, но больше инструментов и исследовательские усилия необходимы для лучшего выяснения механизмов. Для более века, генетически очень шансов справиться с возникающими модель дрозофилы сыграла важную роль в открытие ключевых генов и молекулярные пути, которые оказались весьма сохраняться различных видов. Многие биологические процессы и механизмы болезней функционально консервируют в лету, как развитие (например, план тела, сердца), рак и нейродегенеративных заболеваний. Недавно изучению ожирения и вторичные патологий, таких как болезни сердца в модельных организмов, играет весьма важную роль в выявлении ключевых регуляторов участвующих в метаболического синдрома в организме человека.
Здесь мы предлагаем использовать эту модель организма как эффективный инструмент чтобы вызвать ожирение, то есть, чрезмерное накопление жира и разработать эффективный протокол контролировать содержание жира в виде тегов накопления. В дополнение к весьма сохраняется, но менее сложных генома лету также имеет короткий срок для быстрого экспериментов, в сочетании с экономической эффективности. Этот документ предоставляет подробный протокол для высоких жиров диеты (HFD) кормления у дрозофилы побудить ожирения и высокая пропускная способность assay triacylglyceride (TAG) для измерения связанное с этим увеличение содержание жира, с тем чтобы быть высокую воспроизводимость и эффективно для крупномасштабных генетических или химического скрининга. Эти протоколы предлагают новые возможности эффективно расследовать регламентационных механизмов, участвующих в ожирения, а также предоставляют стандартизированную платформу для исследования обнаружения наркотиков для быстрого тестирования воздействия наркотиков кандидатов на развитие или Профилактика ожирения, диабета и связанных с ними метаболических заболеваний.
Мы находимся в то время где ожирения и ее ассоциированные экономические трудности, является общемировой проблемой1. Два из каждых трех американцев, избыточный вес или страдают ожирением с связанные сердца патологий, основной причиной смерти в течение взрослого населения2. Новые эффективные методы необходимо адекватно расследовать генетические и молекулярные компоненты, замешанных в регуляции метаболического синдрома с помощью модельных организмов. По этой причине мы выбираем модель плодовой мушки Drosophila потому, что он разделяет самых основных биологических процессов с млекопитающих, в том числе мышей и людей3,4,5,6. Геном дрозофилывысоко сохраняется в ходе эволюции, но в целом гораздо меньше с меньше гена дублирования и метаболических сложности, что делает его идеальным для понимания основных механизмов, причастных к многих заболеваний человека4 , 7 , 8. Кроме того, характерные процессы, проведенного жировой ткани, кишечника и поджелудочной железы представлены в лету и посредником функции регулирования в метаболизм глюкозы и липидов, например, которые похожи на людей9, 10,11. Кроме того основные молекулярные пути, участвующие в элементе управления, ожирение, инсулинорезистентность и диабета в организме человека функционально сохраняются в Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. как высших организмов, дрозофила имеет бьющееся сердце, которая образуется в процессе разработки аналогичных процессов,3,млекопитающих сердце17. Таким образом развитие надежной HFD кормления протокол и высокая пропускная способность тег assay, адаптированы для целей эффективного отбора с помощью окна генетических инструмент дрозофилы, обеспечивают важным средством для изучения и понимания генетической основой Базовый комплекс метаболических заболеваний.
HFD еда сама изготавливается из Стандартный лабораторный летать еда дополнена кокосовое масло, которое состоит в основном из насыщенных жирных кислот, известный ассоциироваться с метаболическим синдромом18. В то время как заставить ожирения у млекопитающих моделей, таких как грызуны, может занять месяцы19,20, наши оптимизированные HFD кормления протокол у дрозофилы , можно воспроизвести и эффективно увеличивает научные содержание жира в считанные дни12,14. Этот протокол, в сочетании с высокой пропускной способностью тег assay, позволяет эффективного массового скрининга для эффектов генетических факторов, влияние окружающей среды и наркотиков кандидатов, чтобы обнаружить новые модуляторы жирового обмена. Как следствие, эти протоколы являются скорее всего отношение к понимать и/или борьбы с ожирением и ожирение связанные человеческих патологий.
Кормления протокол универсален и может применяться для изучения метаболизма и функциональных последствий одного насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты. Использование этот assay тег высокой пропускной способности не ограничивается D. melanogaster, но могут быть адаптированы к различным маленькая модель организмов с кутикулы или жесткой внеклеточной матрицы (например, другие Drosophila видов, C. elegans и другие новые модели беспозвоночных организмов) для измерения содержания жира в различных экологических, генетических и физиологических условиях, на любой стадии развития, зрелости или фазы метаболических заболеваний. TAG assay основан на колориметрические измерения ряда ферментативных реакций, которые деградируют теги в свободных жирных кислот, глицерина, глицерин-3-фосфат и, наконец, H2O2 , который реагирует с 4-аминоантипирина (4-АПУ) и 3,5- дихлор-2-гидроксибензол сульфонат (3,5 Омск) производить красный цветной продукт, который измеряется с помощью 96-луночных спектрофотометром.
Индукции ожирением мышей может занять месяцы19,20. В мух этот HFD кормления протокол позволяет для индукции избыточное накопление жира в течение нескольких дней или меньше, вызывая увеличение в накопление жира только после 18 h (см. Рисунок 2). H…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Erika Тейлор для редактирования этой рукописи. Эта работа финансировалась грантов от национальных институтов здравоохранения (P01 HL098053, P01 AG033561 и R01 HL054732) для р.б., добавки пост-докторские исследования (R01 HL085481) и стипендий (AAUW) к S.B.D. и гранты от Американской ассоциации сердца в S.B.D. и R.T.B.
Talboys Ball dropper/bead Dispenser | Talboys | #: 930150 | |
Talboys High Throughput Homogenizer | Talboys | #: 930145 | |
Grinding Balls, Stainless Steel | OPS Diagnostics, LLC | # GBSS 156-5000-01 | 5000 balls |
Masterblock 96 Well deep Microplates | Greiner Bio-One | # T-3058-1 | case of 80 plates |
Greiner 96 well microplate flat bottom | Sigma Aldrich | # M4436 | 40 plates |
Greiner CapMat for sealing multiwell plates | Sigma Aldrich | # C3606 | 50 sealing plates |
Reagent Reservoirs | Thomas Scientific | # 1192T71 | 12/PK |
Thermo Scientific Finnpipette 4661040 | Thermo Scientific | # 4661040 | 1-10 ul multipipette |
Thermo Scientific Finnpipette 4661070 | Thermo Scientific | # 4661070 | 30-300ul multipipette |
Thermo Scientific Finnpipette 4661020 | Thermo Scientific | #4661020 | 10-100ul multipipette |
Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3131-S | for 10 uL pipette |
Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3133-S | for 200 uL pipette |
Multichannel tips | Denville Scientific Inc | #P1125 | for 100 uL pipette |
Forceps | Roboz Surgical | # 5 Dumonts | Super fine forceps |
Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-00 | |
Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-49 | |
96-Well microplate Centrifuge | Hettich Zentrifugen | # Rotina 420R | |
Microplate Reader | Molecular devices | # SpectraMax 190 | |
Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator | Biostad | # 3527 | |
Infinity Triglycerides reagent | Thermo Scientific | # TR22421 | |
Triglyceride Standard | Stanbio | #2103 – 030 | |
Quick Start Bradford Protein Assay | Bio-RAD | # 500-0205 | 1x dye Reagent |
Coconut oil | Nutiva | # 692752200014 | 15 0z jar |
PBS 10X | Thermo Scientific | # AM9625 | 500 ml |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | # 9002-93-1 | |
Gas-permeable Foil | Macherey-Nagel | # 740675 | 50 pieces |
filter Paper | VWR | # 28317-241 | Pack of 100 |
Drosophila vials | Genesee Scientific | Cat #: 32-116SB | |
Quick Start Bovine Serum Albumin Standard | Bio-Rad | # 5000206 | |
FlyNap Anesthetic | Carolina | # 173025 | 100 mL |
Kimwipes Low-Lint | Uline | # S-8115 | 1-Ply, 4.4 x 8.4" |