גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry
Summary
עבודה זו מתארת את סטנדרטיזציה של שיטה להשיג אוכלוסיות תאים נבט מטופלים מרקמת האשכים של מינים שונים של יונקים. זהו פרוטוקול פשוט המשלב דיסוציאציה פשוטה מכנית, מכתים עם Hoechst-33342 ו propidium iodide, ו FACS מיון, עם יישומים רחב במחקרים השוואתיים של ביולוגיה הרבייה הגברית.
Abstract
פלואורסצנטי מופעלת תא מיון (FACS) כבר אחת השיטות של בחירה לבודד אוכלוסיות מועשר של תאים נבטיים יונקים נבט. נכון לעכשיו, זה מאפשר את ההפליה של עד 9 אוכלוסיות Murine תא נבט עם תשואה גבוהה וטוהר. זה ברזולוציה גבוהה של אפליה וטיהור אפשרי בשל שינויים ייחודיים במבנה הכרומטין וכמות לאורך spermatogenesis. דפוסים אלה יכולים להיות שנתפסו על ידי cytometry הזרימה של תאים נבט גבריים מוכתמים פלואורסצנטי DNA מחייב צבעים כגון Hoechst-33342 (Hoechst). הנה תיאור מפורט של פרוטוקול שפותחה לאחרונה לבודד תאים נבטיות יונקים יונקים. בקצרה, השעיות תא בודד נוצרים רקמות האשכים על ידי דיסוציאציה מכנית, מוכתם פעמיים עם Hoechst ו propidium יודיד (PI) ומעובד על ידי cytometry הזרימה. אסטרטגיה gating טורי, כולל הבחירה של תאים חיים (PI שלילי) עם תוכן DNA שונים (עוצמת Hoechst), אניS בשימוש FACS מיון כדי להפלות עד 5 סוגי תאים נבט. אלה כוללים, עם ממוצע purities (נקבע על ידי הערכת מיקרוסקופיה): spermatogonia (66%), העיקרי (71%) ו משני (85%) spermatocytes, ו spermatids (90%), עוד מופרדים לתוך עגול (93%) ו הארכת (87%) subpopulations. ביצוע העבודה כולה הוא פשוט, מאפשר בידוד של 4 סוגי תאים בו זמנית עם מכונת FACS המתאים, והוא יכול להתבצע תוך פחות מ 2 שעות. כמו זמן עיבוד מופחת הוא חיוני כדי לשמר את הפיזיולוגיה של תאים vivo לשעבר , שיטה זו אידיאלית עבור מחקרים במורד הזרם גבוהה של ביולוגיה תא נבט הגברי. יתר על כן, פרוטוקול סטנדרטי עבור טיהור multispecies של תאים נבט יונקים מבטלת מקורות מתודולוגיים של משתנים ומאפשר קבוצה אחת של ריאגנטים לשמש מודלים בעלי חיים שונים.
Introduction
בהינתן היעדר של מערכת חוץ גופית נציג של התקדמות spermatogenesis, ואת הנוכחות של הטרוגניות הסלולר גדול testis, מחקרים של ביולוגיה תא נבט זכר דורשים טכניקות חזקות לבודד אוכלוסיות מועשר של סוגי תאים ספציפיים. פלואורסצנטי המופעל תא מיון (FACS) כבר בשימוש נרחב למטרה זו 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , כפי שהוא מספק תשואה גבוהה טוהר, עולה על שיטות בידוד אחרים במספר סוגי נבט תאים כי הוא יכול לזהות ו בחר 6 , 7 , 8 . העיקרון של ניתוח זרימת cytometry מבוסס על זיהוי של דפוסי אור דיפרנציאלי בעקבות עירור קרן לייזר של תאים בודדים. כמו תא עובר דרך הלייזר הוא משקף / מפזר אורבכל זווית, פרופורציונלית לגודל התא (פיזור קדימה, FSC) ולמורכבות תאיים (פיזור צד, SSC). ראה Ormerod 9 לקבלת מידע מפורט על cytometry הזרימה.
תאי נבט זכריים עוברים שינויים ספציפיים בתכולת הדנ"א, מבנה הכרומטין, גודלו וצורתו לאורך שלבים שונים של הזרע. לפיכך, אוכלוסיות תאים שונים ניתן לזהות ולהפריד על ידי שילוב של פיזור אור מכתים דנ"א עם צבעי ניאון 10 , 11 . מספר צבעים יכולים לשמש למטרה זו (נסקרת ב Geisinger ו רודריגז-Casuriaga 3 ), כגון Hoechst-33342 (Hoechst) אשר שימש לעתים קרובות בניתוח cytometry זרימה של תאים האשכים בעשור האחרון 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . אפוN עירור עם אור UV, Hoechst פולט כחול פלואורסצנטי יחסי לתוכן ה- DNA הסלולר בעוד הקרינה אדום רחוק משקף השתנות במבנה הכרומטין דחיסה 1 , 13 , 14 . כתוצאה מכך, תאים נבט זכר בשלבים שונים של בידול התערוכה דפוסים ספציפיים במהלך FACS של השערות תא בודד מוכתם Hoechst (Ho-FACS, 1 , 12 ). מעניין, בשל מנגנון של זרימת צבע כי הוא פעיל רק בשלב spermatogonial, עוצמת הקרינה הכחולה Hoechst אינו פרופורציונלי לתוכן הכרומטין בתאים אלה, והם אשכול כאוכלוסיית צד במהלך Ho-FACS 15 . בנוסף, שילוב מכתים Hoechst עם יומין propidium יופיים לצבוע (PI) מאפשר למשתמשים להפלות לחיות (PI שלילי) מתאים (PI חיובי) תאים במהלך FACS 1 <Sup>, 2 , 10 , 12 . אסטרטגיה זו שימשה בעבר בניתוח זרימת cytometric של תאים נבטיקולריים ו אופטימיזציה באופן נרחב העכבר להפלות עד 9 סוגי תאים נבט, כולל תאים 4 שלבים שונים של המיוזה אני 1 , 2 , 4 , 16 . לצורך עבודה זו, מכתים Hoechst יש שלושה יתרונות עיקריים. ראשית, Ho-FACS יושמה בהצלחה על בידוד של תאים נבט זכר במודל העכבר 1 , 2 , 12 , ומכרסמים אחרים כגון חולדה ו חזיר 17 , 18 , 19 . שנית, Hoechst הוא צבע תא חדיר ואינו דורש permeabilization הממברנה, ולכן זה preserשלמות תאים Ves. לבסוף, אין צורך בטיפול ב- RNase מאחר שה- Hoechst נקשר באופן מועדף לרצפי DNA של פולי (d [AT]) 1 , 20 , מה שאומר ש- RNA נשמר, ובנוסף לדנ"א ולחלבונים, ניתן להשתמש בו למחקרים מולקולריים נוספים של הנבט התא הבידול.
למרות הדמיון ב- DNA ו / או stainability שנצפו בזרם cytometry ניתוח של מינים יונקים (הנסקרת ב Geisinger ו רודריגז, Casuriaga 3 ), יש כבר מידה רבה של השתנות בפרוטוקולים המתוארים בידוד תא נבט הגברי על ידי cytometry הזרימה. מחקרים שונים השתמשו בפרוטוקולים ספציפיים עבור דיסוציאציה של רקמות, והשתמשו בצבעים שונים של די-אן-אי (לבד או בשילוב) ו- FACS באסטרטגיות מודל שונות, בעיקר עכבר, חולדה וחזירי ים. לפיכך, השוואה ישירה של נתונים שנאספו עבור מינים שונים יכול להיות מושפע על ידי אוקומרכיבים טכניים שלא נוצרו כתוצאה משינויים בין מתודולוגיות. חשוב לציין, שימור מרשים של הדינמיקה הכרומטין לאורך spermatogenesis יונקים (2N-4N-2N-1N) עולה כי פרוטוקול סטנדרטי יכול להיות מיושם על מגוון רחב של מינים יונקים.
מטרת המחקר הנוכחי הייתה לפתח זרימת עבודה אחת כי הוא ישים מינים של יונקים שונים, על ידי שילוב והתאמה טכניקות שפורסמו בעבר 2, 20. סטנדרטיזציה של שיטה לעיבוד רקמות הושגה על ידי ביצוע דיסוציאציה מכנית כדי להתגבר על הצורך מינים ספציפיים התאמות הדרושות לעיכול אנזימטי 5 . ראוי לציין כי ניתוק מכני של רקמת האשכים המכרסמים הוכח לבצע טוב יותר מאשר עיכול רקמות אנזימטיות 20 ו הו FACS של השעיות תא בודד שנוצר על ידי שתי השיטות התערוכהזה תוצאות דומות 5 . כהוכחה עקרונית, פרוטוקול זה מתאר את ההגדרות המשמשים לבודד עד 5 אוכלוסיות תאים נבט: spermatogonia (SPG); ראשוני (SPC I) ו spermatocytes משני (SPC II), ו spermatids (SPD) – סיבוב (rSPD) ו מאריך (eSPD). חשוב לציין, קל ליישם במעבדה, עם הדרישות העיקריות להיות מערכת לרקמות דיסוציאציה וגישה סדרן התא מצויד לייזר UV. זרימת עבודה זו ( איור 1 ) הוא מהיר ופשוט ומאפשר בידוד סימולטני של 4 אוכלוסיות תאים נבט מרקמת האשכים טריים פחות מ 2 שעות. זמן עיבוד מופחת הוא חיוני כדי לשמור על שלמות הסלולר עבור נהלים נוספים במורד הזרם. יתר על כן, הביצועים המוצלחים שלה ב -5 מינים שונים מעידים על כך שניתן להחיל אותה באופן רחב בתוך הצלב היונקי, מה שהופך אותו לשיטה האידיאלית לבודד תאי נבט עבור מחקרים השוואתיים של ביו הרבייה של הרבייה הגבריתאוגי.
פרוטוקול זה מורכב משלושה חלקים עיקריים, מלבד שלבי הכנה: (1) ניתוק מכני של רקמת האשכים ו (2) מכתים של תאים באשכים עם Hoechst ו PI, ואחריו (3) FACS מיון של תאים רלוונטיים spermatogenic. לאחר שנאספו, אוכלוסיות אלה מועשר של תאים שונים נבטיות יונקים תאים יכול לשמש למגוון רחב של יישומים. פרוטוקול זה מתאר "גודל אחד מתאים לכל" שיטת דיסוציאציה לטהר תאים נבט זכר מינים יונקים שונים. בהתאם לסוג המשתמשים במחקר רוצה לנהל עם תאים נבט מבודד, מדיה אחרים או מאגרים ניתן להשתמש. השלבים הבאים פרוטוקול הם להפקת מתלים תא בודד מ testis Murine שלם.
Protocol
Representative Results
Discussion
בהתחשב בדינמיקה הכרומטית המשופרת ביותר במהלך spermatogenesis אצל יונקים, המטרה של עבודה זו היתה לפתח פרוטוקול לבודד תאי נבט גברי בשלבים שונים של בידול מ רקמות שונות של יונקים ( איור 1 ). אחד המכשולים העיקריים ביישום של זרימת עבודה אחת למודלים שונים של בעלי חיי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לבית החולים לבעלי חיים של הילסייד (סנט לואיס, מישיגן) לבדיקות כלבים; ג 'ייסון ארנד ואת המעבדה ד"ר טד Cicero באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס (WashU) על מתן מבחני חולדה בריאן Tabers לסיוע עם האוסף; ג'ארד הרצוק וד"ר סאלט מעבדה בוואשאו לבחינות חזיר השפן; וד"ר מייקל טלקוט בחוג לרפואה השוואתית ב- WashU עבור מבחן החזירים המיניאטורי. החוקרים גם מכירים במרכז הסרטן אלווין ג 'סיטמן בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון, ובית החולים בארנס-יהודי בסנט לואיס, מישיגן, לצורך שימוש ב- Cyman Flow Cytometry Core, שסיפק שירות מיון תא ממוחשב. מרכז הסרטן Siteman נתמך בחלקו על ידי NCI סרטן מרכז תמיכה גרנט # P30 CA91842.
מחקר זה מומן על ידי מלגה דוקטורט FCT [SFRH / BD / 51695/2011 ל ACL], מענקים של המכון הלאומי לבריאות [R01HD078641 ו R01MH101810 DFC] וחוזה מחקר FCT [IF / 01262/2014 ל- AML].
Materials
| 4% paraformaldehyde | VWR | #15710 | 4% PFA, For fixing sorted cells |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System for testis dissociation |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, for testis dissociation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregation cartridge for testis dissociation |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, for FACS ceollction |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, For FACS staining |
| 40µm cell strainer | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | For testis dissociation |
| 100x 15mm petri dish | Falcon | #351029 | For testis dissection |
| 5mL polypropylene round-bottom tubes | Falcon | #352063 | For FACS collection |
| 1.5mL Eppendorf tubes | VWR | #20170-650 | For FACS collection |
| 3mL needless syringe | BD Biosciences | #309657 | For testis dissociation |
| 50mL conical tube | MIDSCI | #C50R | For testis dissociation |
| Propidium Iodide | Invitrogen | #L7011 | PI, For FACS staining |
| MoFlo Legacy cell sorter | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, For microscopy |
| Microscopic glass slide | Fisher Scientific | #12-544-4 | For microscopy |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | For microscopy |
| Disposable transfer pipette (3mL) | Samco Scientific | #225 | For testis dissociation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | For testis dissociation |
| Carbon steel surgical blade | Miltex | #4-111 | For testis dissection |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | #C10227 | For automatic cell counting |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | #T8154 | For viability staining |
References
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr Protoc Cytom. 72, (2015).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
- Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A., Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
- Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39 (2014).
- Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
- Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
- Lassalle, B., et al. ‘Side Population’ cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
- Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
- Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
- Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
- Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
- Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).
