Quadunple Immunostaining של הנורה חוש הריח עבור ויזואליזציה של חוש הריח חושפת אקסון מולקולרית קודי זהות
Summary
חוש הריח נוירונים חושיים מבטאים מגוון רחב של מולקולות מיון האקסון להקים מעגלים עצביים נאותים. פרוטוקול זה מתאר שיטת מכתים immunohistochemical לדמיין ביטויים קומבינטוריים של מולקולות מיון האקסון ב טרמיני האקסון של נוירונים חושית חוש הריח.
Abstract
מערכת חוש הריח של העכבר משמש לעתים קרובות כדי ללמוד מנגנונים של המעגל העצבי היווצרות בגלל המבנה האנטומי הפשוט שלה. חוש הריח נוירון (OSN) הוא תא דו קוטבי עם דנדריט יחיד ואקסון unbranched יחיד. OSN מבטא רק גן אחד קולטן הריח (OR), OSNs להביע סוג נתון של או להתכנס אקסונים שלהם כמה קבוצות של glomeruli קבועים של הנורה חוש הריח (OB). תכונה יוצאת דופן של הקרנת OSN היא כי הביע אורס לשחק תפקידים מאלפת הקרנה axonal. ORs לווסת את הביטוי של מולקולות מיון האקסון מרובים וליצור קוד מולקולרית קומבינטורית של מולקולות מיון האקסון ב Termini האקסון OSN. לכן, כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של מנגנוני הדרכה האקסון ספציפי, חשוב לאפיין את פרופילי הביטוי שלהם ב טרמיני האקסון OSN בתוך glomerulus אותו. מטרת מאמר זה היה להציג שיטות לאיסוף כמו glomeruli רבים כמו possiblדואר על סעיף OB בודד ועל ביצוע immunostaining באמצעות נוגדנים מרובים. זה יאפשר השוואה וניתוח של דפוסי הביטוי של אקסון מיון מולקולות ללא מכתים וריאציה בין סעיפים OB.
Introduction
במהלך ההתפתחות, נוירונים מחוברים זה לזה בדיוק כדי ליצור מעגלים עצביים נאותים, קריטיים לתפקוד המוח הרגיל. מאחר שמעגלים עצביים חריגים במוח נחשבים כגורמים להפרעות נפשיות כגון אוטיזם וסכיזופרניה, ההבנה של מנגנוני המעגל העצבי היא אחד האתגרים המרכזיים בתחום מדעי המוח.
במערכת חוש הריח של העכבר, כל נוירון חושני חוש הריח (OSN) באפיתל חוש הריח (OE) מבטא רק גן אחד של קולטן חוש הריחתי (OS) או OSNs המבטאים אותו או מתמזגים עם האקסונים שלהם לצמד מסוים של גלומרולי במיקומים סטריאוטיפיים חוש הריח Bulb (OB) 1 , 2 . מערכת הריח העכבר היא מערכת מודל מעולה לחקר המנגנונים המולקולריים של היווצרות מעגל עצבי כי החוקרים יכולים לנצל את הביטוי OR לזהות ספציפייםUbtype של OSNs לדמיין את אתרי ההקרנה של האקסונים OSN כמו מבנים glomerular ברור. תכונה יוצאת דופן של הקרנת OSN היא כי אורס לשחק תפקידים מאלפת הקרנת אקסונים OSN ל OB 3 , 4 , 5 , 6 . באופן ספציפי יותר, לאחר שהאקסונים של OSN מודרכים לאזורי יעד משוערים, הם מופרדים ליצירת גלומרולוס באופן תלוי-תלות. מחקרים קודמים הראו כי מולקולות או לשלוט על הביטוי של המולקולות מיון האקסון, אשר להסדיר הפרדה glomerular 7 , 8 . יתר על כן, ראיות מצטברות עולה כי מולקולות או לייצר את קוד הזהות העצבית על ידי שילוב ייחודי של מולקולות מיון האקסון 9 . לכן, כדי להבין את המנגנון של הפרדת גלומרולרי תלותית, יש צורך לאפיין את הביטוי פרופילים של מיון האקסון molEcules ב OSNs.
פלואורסצנטי immunostaining היא שיטה נפוצה לדמיין את הביטוי של גנים ספציפיים. מאז חלבונים של מולקולות מיון האקסון ממוקמים בעיקר על האקסונים OSN, החוקרים צריכים להשתמש סעיפים OB לאפיין את דפוסי הביטוי שלהם OSNs. חתך העטרה של OB שימש באופן שגרתי עבור immunostaining. עם זאת, הכנה זו מאבדת את המידע הטופוגרפי לאורך הציר הקדמי-אחורי באותו קטע OB. לכן פיתחנו הכנה parasagittal של הצד המדיאלי של OB, אשר יכול לעלות כמו glomeruli רבים סביב סביב באותו סעיף OB. בשילוב עם immunostaining באמצעות נוגדנים מרובים, הכנה זו מאפשרת השוואה וניתוח של דפוסי הביטוי של אקסון מיון מולקולות ללא מכתים וריאציה בין סעיפים OB.
יתר על כן, שיטת מכתים immunohistochemical הוצגה ללא קיבוע לאחר עם PFA אטיפול סוכרוז nd. שיטה זו מאפשרת לחוקרים להשיג מספיק נתונים באיכות גבוהה מכתים לניתוח נתונים רב משתנים. הפרוטוקולים המוצגים כאן יספק פרטים על שיטות רבות עוצמה לחוקרים אשר לומדים את היווצרות מעגלים עצביים חוש הריח.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quadostple immunostaining של parasagittal סעיפים OB אפשרה להדמיה וכימות של רמות ביטוי של רבים כמו ארבעה מולקולות מיון האקסון בו זמנית במספר גדול יותר של glomeruli. על ידי ניתוח נתונים אלה רב משתנים עם PCA, את המאפיינים של הביטוי של מולקולות אלה ניתן לשער.
?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן מיצובישי, קרן המדע של Takeda, JST PRESTO ו- JSPS KAKENHI Grant מספר 16H06144.
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| Skim Milk | nacalai tesque | 31149-75 | |
| goat anti-Sema7A antibody | R&D Systems | AF2068 | |
| rat anti-OLPC antibody | Merck Millipore | MABT20 | |
| mouse anti-VGLUT2 antibody | Merck Millipore | MAB5504 | |
| goat anti-BIG-2 antibody | R&D Systems | AF2205 | |
| gunea pig anti-Kirrel2 antibody | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP | |
| donkey anti-mouse Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| MAS coated slide glasses | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI filter cube | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP filter cube | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC filter cube | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 filter cube | KEYENCE | OP-87766 | |
| filter paper | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | M71484 |
References
- Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain?. Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).
- Takeuchi, H., Sakano, H. Neural map formation in the mouse olfactory system. Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).
- Mombaerts, P., et al. Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87, 675-686 (1996).
- Feinstein, P., Mombaerts, P. A contextual model for axonal sorting into glomeruli in the mouse olfactory system. Cell. 117, 817-831 (2004).
- Ishii, T., et al. Monoallelic expression of the odourant receptor gene and axonal projection of olfactory sensory neurones. Genes Cell. 6, 71-78 (2001).
- Nakashima, A., et al. Agonist-independent GPCR activity regulates anterior-posterior targeting of olfactory sensory neurons. Cell. 154, 1314-1325 (2013).
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127, 1057-1069 (2006).
- Kaneko-Goto, T., Yoshihara, S., Miyazaki, H., Yoshihara, Y. BIG-2 mediates olfactory axon convergence to target glomeruli. Neuron. 57, 834-846 (2008).
- Ihara, N., Nakashima, A., Hoshina, N., Ikegaya, Y., Takeuchi, H. Differential expression of axon-sorting molecules in mouse olfactory sensory neurons. Eur J Neuro. 44, 1998-2003 (2016).
- Williams, E. O., et al. Delta Protocadherin 10 is Regulated by Activity in the Mouse Main Olfactory System. Front Neural Circuits. 5, 9 (2011).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).
