Summary

Osmotik Pompalar veya Doğrudan Kas Enjeksiyonu Kullanılarak Subkutanöz Neurotrophin 4 İnfüzyonu, Yaşlanan Farenin Larinks Kaslarını Arttırır

Published: June 13, 2017
doi:

Summary

Burada, sistemik olarak ve direkt olarak sıçan yaşlanmasına bağlı laringeal kasların yeniden şekillendirilmesi için nevrotropin 4'ü (NTF4) tanımlamak için bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Yaşlılarda laringeal işlev bozukluğu, ses bozukluklarından disfajiye ve hava yolu koruyucu reflekslerde azalmaya neden olan önemli bir sakatlık nedenidir. Yaşa bağlı laringeal kas disfonksiyonunu hedef alan az sayıda, varsa, terapiler mevcuttur. Nörotrofinler, kas innervasyonu ve nöromüsküler kavşakların (NMJ'lerin) farklılaşmasına katılırlar. Nörotrofinlerin nörotransmitter salınımını arttırarak nöromüsküler iletimi arttırdığı düşünülmektedir. Nöromusküler kavşaklar (NMJ'ler) fonksiyonel denervasyon bulguları ile sıçan laringeal kas yaşlanmasında daha küçük ve daha az miktarda bulunur. İnsanın laringeal kas yaşlanmasında fonksiyon geliştirmek için NTF4'ün ileride klinik kullanıma yönelik terapötik olarak etkilerini araştırdık. Burada, sıçan laringeal kasının yaşlanması NTF4 uygulamasına tepki olarak yeniden şekillenme yeteneğini araştırmak için sistemik uygulama ve doğrudan NTF4 enjeksiyonu için ayrıntılı protokolü sunuyoruz. Bu yöntemde, sıçanlar NTF4'ü ya sistemik olarak oSmotik pompa veya vokal kıvrımlar yoluyla doğrudan enjeksiyon yoluyla uygulanabilir. Larinks kasları ayrıldı ve morfolojinin histolojik incelenmesi ve yaşla ilişkili denervasyon için kullanıldı.

Introduction

Larinks kasları hızla ve sürekli olarak kasılır ve yaşlanmanın olumsuz etkilerine karşı savunmasızdır. Bu sabit etkinliğin, 65 yaş üzerindeki 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 numaralı kişilerde görülen ses problemlerine veya disfajiye katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Birkaç moleküler ve patofizyolojik mekanizma bu yaşla ilişkili disfonksiyona katkıda bulunmaktadır. Bu mekanizmalar laringeal mukozanın yeniden şekillendirilmesi, kas lifi atrofisi veya kaybı, vasküler kıvrımların eğilmesine ve glottis kapanmasının başarısız olmasına neden olan kas lifi rejenerasyonu veya atrofisinin eksikliği içerebilir 8,9,10,11. Şu anda, kanıtlanmış bir tıbbi tedavi yoktur.Bu kaslarda bu yaşa bağlı değişiklikleri kolayca önlemek veya rehabilite etmek.

Nöromüsküler bulaşmanın etkinliğinin modülasyonu, nöromotor performansı büyük ölçüde etkiler. Nörotrofinin ailesi, sinir büyüme faktörü (NGF), beyin türevi sinir büyüme faktörü (BDNF), nörotrofin 3 (NTF3) ve NTF4 12 , 13'ü içerir . Nörotrofinlerin sinaptik etkinliği 1 , 4'ü modüle ettiği gösterilmiştir. Hepatosit büyüme faktörü, dönüştürücü büyüme faktörü beta ve fibroblast büyüme faktörü son zamanlarda insanlarda vokal kıvrım skarlanması 15-17 tedavisinde kullanılmıştır. NTF4 ayrıca NMJ etkinliğini düzenler; NTF4'ten yoksun fareler , 11 , 18 , 19 numaralı NMJ'leri parçalamıştır. Bu çalışmalar, tedavi edici etkilere yol açmaktadırLaringeal kas bozukluklarının yaşlanması ve büyüme faktörleri ile denervasyon.

Vokal kıvrımların dokularına direkt enjeksiyon tedavileri insanlarda eşi benzeri görülmez. Örneğin, botulinum toksininin lokal enjeksiyonları şu anda spazmodik disfoni ve bilateral tekrarlayan laringeal sinir paralizisi gibi larenks kaslarını etkileyen nörolojik hareket bozuklukları için etkili bir tedavi olarak kullanılmaktadır 20,21. Hyaluronik asit hidrojel, vokal kat korkutma ve glotal yetmezliği tedavi etmek için kullanılan başka bir enjekte edilebilir 22 , 23 . Enjeksiyon larinkoplasti, çeşitli iletişim bozukluklarını tedavi etmek için kullanılabilir 24 . Bu doğrudan enjeksiyon yöntemleri vokal fonksiyonu iyileştirmek ve yaşlanan popülasyonlarda yutmak için söz verir.

Protocol

Bu protokol için 6 ve 30 aylıkken erkek Fischer 344-Brown Norveç sıçanları kullanın. Sıçanlar Ulusal Yaşlanma Enstitüsü'nden kemirgen koloni elde edildi. Bu çalışma için sıçanlar kullandık, çünkü sıçan larenksinin yapısı, havayolu koruması ve türe özgü seslendirme işlevini yerine getiren işlevsel olarak insandakine benzerdi. Bu çalışma, PHS İnsan Gücü Bakımı ve Laboratuar Hayvanları Kullanımı, Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için NIH Rehberi ve Hayvan Re…

Representative Results

Sıçanlar, 2 hafta ozmotik pompa infüzyonundan sonra veya NTF4'ün doğrudan enjeksiyonundan 1 hafta sonra ötenazi yapıldı. Larenjler hasat edildi, kriyoprotektan (% 30 sükroz ve% 70 fosfat tamponlu salin) içine yerleştirildi ve daha sonra bir kriyostat ile 10 um'lik genişlikte kesit olarak kesildi. Yaşlanma laringeal kasları, NTF4 25'in uygulanmasından etkilenir. Genç ve yaşlı sıçanın yanısıra, tiroidenoid kasların enjekte edilen …

Discussion

Larinks kasları yaşlanmanın olumsuz etkilerine karşı savunmasızdır. Önceki çalışmalar, kontraktil fonksi- yon ve miyozin izoform değişikliklerine ek olarak lif boyutu, toplam lif sayısı, rejeneratif yeteneği, NMJ boyutu ve miktarı değişikliklerini içeren yaşlanma laringeal kaslarında değişiklikler olduğunu göstermiştir 4 , 11 , 27 , 30 ,

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsünün (R21DC010806'dan CAM ve JCS'ye ve R01DC011285'den CAM'e) hibeleriyle desteklendi.

Materials

Neurotrophin 4 Pepro Tech 450-04 200ng in 50μl
Alzet Osmotic Pump DURECT Corporation 2001D
30° endoscope Stoltz 61029D
50mm 30 gauge 100-μl syringe Hamilton 84850 and 201812
saline (sodium chloride solution) Sigma-Aldrich S8776
ketamine hydrochloride Henry Schein 56344
xylazine hydrochloride Henry Schein 33198
25 G 5/8 needle Becton-Dickinson 305901
1 ml syringe Becton-Dickinson 309659
ophthalmic ointment Henry Schein 8897
clippers Oster 44-018
ethanol Decon 2716
iodine (Betadine) Purdue Pharma L.P. 606404
heating pad Sunbeam 731-5
5-0 nylon suture thread AD Surgical PMN-518R6
crile hemostat Fine Science Tools 13005-14
delicate suture tying forceps Fine Science Tools 11063-07
meloxicam Henry Schein 49756
carprofen Merritt Veterinary Supplies 148700
antibiotic ointment Henry Schein 57110
acepromizine Aceproject Henry Schein 3845
isoflurane Isothesia Henry Schein 50033
induction box (anesthetizing box) Harvard Apparatus 50-0116
oxygen compressed tank Scott Gross UN1072
plexiglas platform Small Parts Inc (Amazon)
rubber tipped forceps Fine science tools rubber 11075-00
liquid rubber for forceps above Lowe's 42518
plastic spectula (BD syringe cut to length) Becton-Dickinson 309659
halogen light source rhino-laryngeal stroboscope Kay-Pentax RLS 9100 B
video recorder Kay-Pentax
sucrose Sigma-Aldrich S0389-500G
phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
cryostat Mictotom HM525 Thermo Scientific HM 525
Gill 1 hematoxylin VWR 10143-142
Shandon eosin-Y alcoholic Thermo Fisher Scientific 6766007
anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit Sigma-Aldrich S0819
Texas red-X phalloidin Sigma-Aldrich T7471
alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific B-13422
Small animal anaesthesia machine Smiths Medical CDS 9000

References

  1. Trupe, E. H., et al. Correlates and consequences of eating dependency in institutionalized elderly. J. Am. Geriatrics Society. 34 (3), 192-198 (1986).
  2. Ward, P. H., Colton, R., McConnell, F., Malmgren, L., Kashima, H., Woodson, G. Aging of the voice and swallowing. Otolaryngol. Head Neck Surg. 100 (4), 283-286 (1989).
  3. Gay, E. G., Kronenfeld, J. J., Dettmann, F. G. A comparison on the effect of regulation on health care for the older American: a tale of two states. Gerontologist. 34 (6), 787-796 (1994).
  4. Hagen, P., Lyons, G. D., Nuss, D. W. Dysphonia in the elderly:diagnosis and management of age-related voice changes. South. Med. J. 89 (2), 204-207 (1996).
  5. Broniatowski, M., et al. Current evaluation and treatment of patients with swallowing disorders. Otolaryngol. Head Neck Surgery. 120 (4), 464-473 (1999).
  6. Lundy, D. S., et al. Aspiration: cause and implications. Otolaryngol. Head Neck Surg. 120 (4), 474-478 (1999).
  7. Schindler, J. S., Kelly, J. H. Swallowing disorders in the elderly. Laryngoscope. 112 (4), 589-602 (2002).
  8. Gambino, D. R., Malmgren, L. T., Gacek, R. R. Age-related changes in the neuromuscular junctions in the human posterior cricoarytenoid muscles: a quantitative study. Laryngoscope. 100 (3), 262-268 (1990).
  9. Sinard, R. J. The aging voice: how to differentiate disease from normal changes. Geriatrics. 53 (7), 76-79 (1998).
  10. Baker, K. K., Olson-Raming, L., Sapir, S., Luschei, E. S., Smith, M. E. Control of vocal loudness in young and old adults. J. Speech Lang. Hear Res. 44 (2), 297-305 (2001).
  11. McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 64 (4), 435-442 (2009).
  12. Lai, K., Ip, N. Y. Postsynaptic signaling of new players at the neuromuscular junction. J. Neurocytol. 32 (5-8), 727-741 (2003).
  13. Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24 (1), 677-736 (2012).
  14. Gonzalez, M., et al. Disruption of Trkb mediated signaling induces disassembly of postsynaptic receptor clusters at neuromuscular junctions. Neuron. 24 (3), 567-583 (1999).
  15. Hirano, S., Kishimoto, Y., Suehiro, A., Kanemaru, S., Ito, J. Regeneration of aged vocal folds: first human case treated with fibroblast growth factor. Laryngoscope. 118 (12), 2254-2259 (2008).
  16. Branski, R. C., et al. Effects of transforming growth factor-beta 1 on human vocal fold fibroblasts. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 118 (3), 218-226 (2009).
  17. Kishimoto, Y., et al. Effects of exogenous hepatocyte growth factor on vocal fold fibroblasts. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 118 (8), 606-611 (2009).
  18. Belluardo, N., et al. Neuromuscular junction disassembly and muscle fatigue in mice lacking neurotrophin-4. Mol. Cell. Neurosci. 18 (1), 56-57 (2001).
  19. Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanisms in the old rat. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (12), 1458-1468 (2013).
  20. Roscow, D. E., Parikh, P., Vivero, R. J., Casiano, R. R., Lundy, D. S. Considerations for initial dosing of botulinum toxin in treatment of adductor spasmodic dysphonia. Oto. HeadNeck Surg. 148 (6), 1003-1006 (2013).
  21. Benninger, M. S., Hanick, A., Hicks, D. M. Cricothyroid muscle botulinum toxin injection to improve airway for bilateral recurrent laryngeal nerve paralysis, A case series. J. Voice. 30 (1), 96-99 (2016).
  22. Coppoolse, J. M. S., et al. An in vivo study of composite microgels based on hyaluronic acid and gelatin for the reconstruction of surgically injured rat vocal folds. J. Speech Lang Hear Res. 57 (2), S658-S673 (2014).
  23. Hertegård, S., et al. Cross-linked hyaluronan used as augmentation substance for treatment of glottal insufficiency: Safety aspects and vocal fold function. Laryngoscope. 112 (12), 2211-2219 (2002).
  24. Walker, W. F., Homberger, D. G. . Anatomy and dissection of the rat. , (1997).
  25. Ohno, T., Hirano, S., Rousseau, B. Age-associated changes in the expression and deposition of vocal fold collagen and hyaluronan. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 25 (1), 192-197 (2009).
  26. Stemple, J. C., et al. Enhancement of aging rat laryngeal muscles with endogenous growth factor treatment. Physiol. Rep. 4 (10), e12798 (2016).
  27. McMullen, C. A., Andrade, F. H. Contractile dysfunction and altered metabolic profile of the aging rat thyroarytenoid muscle. J. Appl. Phys. 100 (2), 602-608 (2006).
  28. Engle, W. K., Cunningham, G. C. Rapid examination of muscle tissue. An improved trichrome method for fresh-frozen biopsy section. Neurology. (13), 919-923 (1963).
  29. Sheehan, D. C., Hrapchack, B. B. Theory and practice of histotechnology. Battelle. , (1980).
  30. Kulakowski, S. A., Parker, S. D., Personius, K. E. Reduced TrkB expression results in precocious age-like changes in neuromuscular structure, neurotransmission, and muscle function. J. Appl. Phys. 111 (3), 844-852 (2011).
  31. Nishida, N., et al. Age-related change in rat intrinsic laryngeal muscles: analysis of muscle fibers, muscle fiber proteins and subneural apparatuses. Eur Arch Otorhinolaryngol. 270 (3), 975-984 (2013).

Play Video

Cite This Article
Andreatta, R. D., Stemple, J. C., Seward, T. S., McMullen, C. A. Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles. J. Vis. Exp. (124), e55837, doi:10.3791/55837 (2017).

View Video