إثراء مجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من الدماغ البشري تشريح الجثة
Summary
ويرد وصف بروتوكولا تجزئة مختصر لإثراء المجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من الدماغ البشري تشريح الجثة.
Abstract
في هذه الدراسة، ونحن تصف بروتوكولا يختصر خطوة واحدة تجزئة لإثراء المجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من الدماغ البشري تشريح الجثة. المنظفات الأيونية ن-سولفات-ساركوسيني (ساركوسيل) سولوبيليزيس فعالية البروتينات مطوية أصلاً في أنسجة المخ مما يسمح في إثراء المجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من طائفة واسعة من بروتينوباثيس الأعصاب، مثل مرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون والتصلب العضلي الجانبي وأمراض بريون. كانت سيطرة الإنسان وأنسجة المخ تشريح الجثة الإعلانية المتجانس ورسابه تنبيذ فائق حضور ساركوسيل لإثراء المجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات الصناعية بما في ذلك تاو فوسفوريلاتيد باثولوجي، العنصر الأساسي من نيوروفيبريلاري التشابك في الإعلان. النشاف الغربية أظهرت أن القابلية للذوبان التفاضلية تاو فوسفوريلاتيد مجمعة والبروتين للذوبان المنظفات، 1 مستضد دخلول المبكر (EEA1) في السيطرة والدماغ الإعلانية. كما كشف تحليل البروتين إثراء بيتا-اميلويد (Aβ)، تاو، snRNP70 (U1-70 ك)، والابوليبوبروتين ه (الذين) في كسور الدماغ الإعلانية مقارنة بتلك التي تحكم، تمشيا مع الاستراتيجيات السابقة في وجود أنسجة تستعصي على الحل ساركوسيل . وهكذا، هذا البروتوكول تخصيب بسيطة مثالية لمجموعة واسعة من تطبيقات تجريبية بدءاً من النشاف الغربية والبروتين وظيفية فحوصات التجميع المشارك البروتيوميات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي.
Introduction
أمراض الأعصاب مثل مرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD) ومرض هنتنغتون (HD)، والتصلب العضلي الجانبي (المرض) وأمراض بريون وثيق الصلة بروتينوباثيس تتميز بتراكم تدريجي انخفاض المجاميع البروتين المنظفات الذوبان في الدماغ مع مرافقة المعرفية. 1 , ويعتقد أن تلعب دوراً مركزياً في المسببات والفيزيولوجيا المرضية لهذه الأمراض الأعصاب 2 هذه الميزة المرضية المشتركة. 2 هذه المجاميع وعادة ما تتألف من ألياف اميلويد البوليمرية، التي تتكون من تكرار وحدات من البروتين تجمعات العارضة عبر β-الهيكل. 1 , 2 , 3 , 4 المتحلل، المجاميع اميلويد هي شديدة المقاومة تمسخ الكيميائية أو الحرارية وسولوبيليزيشن،3 التي تشكل تحديات فريدة من نوعها لتنقية بهم، تحليل ودراسة عن طريق التقنيات الحيوية التقليدية. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 لا غرابة، الكسر البروتين تستعصي على الحل المنظفات قد تم تركيز الكثير من البحوث في الفسيولوجيا المرضية لأمراض الأعصاب التي تشمل تراكم البروتينات تجمعات. 6 , 12 , 13 , 14
كثيرا ما استخدمت تقنيات تجزئة البيوكيميائية لإثراء الكسر تستعصي على الحل المنظفات من homogenates الدماغ تشريح الجثة. 6 , 12 , 13 , 14 واحد من الأساليب الأكثر شيوعاً يشمل استخراج متسلسلة من الأنسجة هوموجيناتيس مع المخازن المؤقتة والمنظفات الصناعية المتزايدة الصرامة، تليها تنبيذ فائق لتقسيم الكسور القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان. 6،بروتوكول14 تجزئة متسلسلة استخداماً ينطوي على تجانس عينات الأنسجة المجمدة في منطقة عازلة خالية من المنظفات منخفضة ملح (LS) والكريات الناتجة غير قابلة للذوبان ثم تستخرج تسلسلياً مع المخازن المؤقتة التي تحتوي على الملح عالية، والمنظفات غير الأيونية، السكروز عالية، المنظفات الأيونية، وأخيراً تشاوتروبيس مثل اليوريا. 6 , 14 هو عيب واضح من هذه البروتوكولات تجزئة متسلسلة وقت كبير والتزام العمل المطلوب لإكمال لهم. بما في ذلك التجانس وتنبيذ فائق، يمكن اتخاذ بروتوكول نموذجي خمس خطوات تجزئة عدة ساعات أو حتى أيام لاستكمال. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 بالإضافة إلى ذلك، يظل العديد من البروتين باثولوجي المجاميع غير قابلة للذوبان في جميع ولكن ظروف أقسى19،20 معظم الكسور التي تم إنشاؤها ذات قيمة محدودة. وهكذا، خطوات تجزئة أقل صرامة استخدام تركيزات عالية من الملح والمنظفات غير الأيونية زائدة عن الحاجة إلى حد كبير.
وقد أظهرت الدراسات السابقة أن المنظفات الأيونية ن-سولفات-ساركوسيني (ساركوسيل) مرشح ممتاز لبروتوكول مبسط تجزئة منظفات في خطوة واحدة. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 كمطهر يشوه، ساركوسيل صرامة ما يكفي جعل الغالبية العظمى من البروتينات مطوية أصلاً في الدماغ دون سولوبيليزينج المجاميع البروتين تجمعات تتألف من اميلويد بيتا (Aβ)،6،11 تاو فوسفوريلاتيد (بتاو)،6 “القطران الحمض النووي” ملزم بروتين 43 (ماساتشوستس-43)،14 ألفا-سينوكلين أو الرعاش13 12،،23 أو U1 الصغيرة النووية ريبونوكليوبروتينس (U1 سنرنبس) مثل U1-70 ك. 5 , 21 , 22 كما ساركوسيل أقل صرامة من كبريتات دوديسيل الصوديوم المنظفات أنيونى في كل مكان (SDS)، فإنه يحافظ على أشكال oligomeric أقل متانة من المجاميع تجمعات البروتين التي لا يمكن أن تصمد أمام معاملة الحزب الديمقراطي الصربي. 9
سابقا، يمكننا وصف بروتوكولا المنظفات-تجزئة مختصر الذي حقق نتائج قابلة للمقارنة للمنهجيات تجزئة متسلسلة أكثر شاقة. 5 بحذف الخطوات تجزئة أقل صرامة، استطعنا أن وضع بروتوكول تجزئة خطوة واحدة سهلة لإثراء المجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من الدماغ البشري تشريح الجثة. 5 هذا البروتوكول التفصيلية الموضحة هنا مناسبة تماما لمجموعة واسعة من التطبيقات التجريبية تتراوح من النشاف الغربية وفحوصات البروتيوميات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي misfolding البروتين وظيفية والبذر التجميع. 5 , 6 , 21
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا يمكننا إدخال ومناقشة بروتوكول المنظفات-تجزئة خطوة واحدة مختصرة التي تنطبق على مجموعة متنوعة من تطبيقات تجريبية تتراوح بين التحليل الشامل القائم على قياس الطيف الكتلي البروتيوميات البروتين وظيفية misfolding فحوصات والنشاف الغربية. 5 , 6 , 7…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتور جيم لاه وليفي الآن، إدارة أموري لطب الأعصاب، اقتراحات وتعليقات مفيدة. تم تمويل هذا العمل جزئيا “التعجيل بالشراكة الطب” المنحة (U01AG046161-02)، مرض الزهايمر أموري لمنح مركز بحوث الأمراض (P50AG025688) والمعهد الوطني الشيخوخة (R01AG053960-01) إلى N.T.S. هذا البحث أيضا تدعمها جزئيا “جوهر” المنحة “أموري علم الأعصاب NINDS المرافق الأساسية”، P30NS055077 أمراض الأعصاب.
Materials
| Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) | Thermo Fisher | 78441 | protease & phosphatase inhibitor cocktail |
| Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) | Fisher Scientific | FB505110 | microtip ultrasonicator |
| Optimax TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361545 | refrigerated ultracentrifuge |
| TLA120.1 rotor | Beckman Coulter | 362224 | ultracentrifuge rotor |
| 500 ul (8x34mm) polycarbonate tubes, thickwall | Beckman Coulter | 343776 | ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor |
| 4X SDS sample buffer | Home-made | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP solution, neutral pH | Thermo Fisher | 77720 | reducing agent |
| (TBS) blocking buffer | Thermo Fisher | 37542 | blocking buffer |
| (TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | blocking buffer and antibody diluent |
| 4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well | Thermo Fisher | NW04120BOX | precast SDS-PAGE gels |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE running buffer |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma Aldrich | L5777-50G | detergent |
| 1.5 ml polypropylene Pellet Pestle | Kimble Chase | 749521-1500 | homogenization tool |
| cordless motor for Pellet Pestle | Kimble Chase | 749540-0000 | homogenization tool |
| Anti-Tau-2 (pan tau) antibody | Chemicon | MAB375 | antibodies |
| Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody | Millipore | MAB5450 | antibodies |
| Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | antibodies |
| Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody | abcam | ab2900 | antibodies |
| Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A21058 | antibodies |
| Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A11374 | antibodies |
| iBlot2 Dry Blotting System | Thermo Fisher | IB21001 | Gel transfer |
| iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini | Thermo Fisher | IB23002 | Gel transfer |
References
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991 (1991).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
- Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
- Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist’s Perspective. Role in Alzheimer’s and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
- Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
- Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer’s Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
- Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer’s Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
- Julien, C., Bretteville, A., Planel, E., Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. . Amyloid Proteins: Methods and Protocols. , 473-491 (2012).
- Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).
- Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
- Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. FASEB J. , (2005).
- Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
- Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130 (2006).
- Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
- Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer’s β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
- Yang, L. -. S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer’s disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).
- Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
- Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer’s Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer’s disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer’s brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
- Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer’s disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).
