Summary

Induktion von Hypoxie im lebenden Frosch und Zebrafisch Embryonen

Published: June 26, 2017
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Summary

Wir stellen ein neuartiges hypoxisches Kammersystem für die Verwendung mit Wasserorganismen wie Frosch und Zebrafisch-Embryonen vor. Unser System ist einfach, robust, kostengünstig und ermöglicht die Induktion und Aufrechterhaltung der Hypoxie in vivo und für bis zu 48 h. Wir präsentieren 2 reproduzierbare Methoden zur Überwachung der Wirksamkeit der Hypoxie.

Abstract

Hier stellen wir ein neuartiges System zur Hypoxie-Induktion vor, das wir entwickelt haben, um die Auswirkungen von Hypoxie in Wasserorganismen wie Frosch und Zebrafisch-Embryonen zu untersuchen. Unser System besteht aus einer Kammer mit einem einfachen Aufbau, der dennoch robust ist, um eine spezifische Sauerstoffkonzentration und Temperatur in jeder experimentellen Lösung der Wahl zu induzieren und aufrechtzuerhalten. Das dargestellte System ist sehr kostengünstig, aber hochfunktionell, ermöglicht die Induktion und Erhaltung von Hypoxie für direkte Experimente in vivo und für verschiedene Zeiträume bis zu 48 h.

Um die Wirkungen von Hypoxie zu überwachen und zu untersuchen, haben wir zwei Methoden angewendet – die Messung der Ebenen des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1alpha (HIF-1α) in ganzen Embryonen oder spezifischen Geweben und die Bestimmung der retinalen Stammzellproliferation durch 5-Ethinyl-2'- Desoxyuridin (EdU) Einarbeitung in die DNA. HIF-1α-Spiegel können als allgemeiner Hypoxie-Marker im ganzen Embryo oder Gewebe dienenDer Wahl, hier embryonale Netzhaut. EdU-Inkorporation in die proliferierenden Zellen der embryonalen Retina ist eine spezifische Ausgabe der Hypoxie-Induktion. So haben wir gezeigt, dass hypoxische embryonale Netzhautvorläufer die Proliferation innerhalb von 1 h der Inkubation unter 5% Sauerstoff sowohl von Frosch als auch von Zebrafischembryonen verringern.

Einmal gemeistert, kann unser Setup für die Verwendung mit kleinen aquatischen Modellorganismen, für direkte in vivo Experimente, jede gegebene Zeitspanne und unter normaler, hypoxischer oder hyperoxischer Sauerstoffkonzentration oder unter irgendeinem anderen Gasgemisch eingesetzt werden.

Introduction

Hypoxie-Forschung hat zahlreiche Anwendungen. Dazu gehören die Untersuchung der Pathogenese und die Entwicklung von Behandlungen für medizinische Zustände, die durch Hypoxie 1 und akute Höhenkrankheit gekennzeichnet sind 2 . Hypoxischer Stress verursacht große metabolische Veränderungen in allen Organismen, die Sauerstoff benötigen. Hypoxischer Stress beeinflusst auch das fetale Wachstum und die Entwicklung und die Pathogenese mehrerer menschlicher Krankheiten, einschließlich der intrauterinen Wachstumsbeschränkung 3 . Hypoxischer Stress kann nicht nur zu reduziertem Geburtsgewicht, fetaler und neonataler Mortalität führen, sondern kann auch zu vielen Komplikationen im Erwachsenenleben führen, wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Typ-2-Diabetes, Fettleibigkeit und Hypertonie 4 . Ein hypoxischer Stress wird auch häufig während der soliden Tumorentwicklung beobachtet, wenn das Tumorgewebe seine Blutversorgung erweitert. Es ist daher entscheidend, die Auswirkungen von Hypoxie in vivo und direkt während der Embr Yonische Entwicklung.

Unter den bekanntesten Methoden, die zur Untersuchung von Wirkungen von Hypoxie während der Entwicklung angewendet wurden, ist die Verwendung von Kobaltchlorid im Wachstumsmedium oder die Inkubation des Organismus in einer hypoxischen Kammer. Kobaltchlorid induziert aufgrund seiner Rolle bei der Stabilisierung von hypoxieinduzierbarem Faktor-1 alpha (HIF-1α) durch die Verhinderung seines proteosomalen Abbaus 5 , 6 , 7 künstlich eine hypoxische Reaktion unter normaler Sauerstoffkonzentration. Allerdings kann die Verwendung von Cobaltchlorid sowie anderer ähnlicher chemischer Hypoxie-Mimetika eine unspezifische schädliche Wirkung auf Zellen und Gewebe, z . B. Apoptose 9, aufweisen . Daher sind hypoxische Kammern eine bessere Methode zur Induktion von "natürlicher Hypoxie" in lebenden Organismen durch den Verlauf der normalen Entwicklung.

Wir haben uns auf die Entwicklung eines Systems zur Induktion von Hypoxie in Wassertierembryonen konzentriert. Beide Frösche und Zebrafisch sind mittlerweile zu informativen Wirbeltiermodellorganismen für Studien zahlreicher biologischer Prozesse sowie zu Modellen für verschiedene menschliche Krankheiten geworden. Frosch- und Zebrafisch-Embryonen Entwickeln sich nach außen, eliminieren die Komplikation der mütterlichen Kompensation, und ein schneller Entwicklungsverlauf ermöglicht es, Umweltfaktoren zu manipulieren und die phänotypischen Veränderungen der Organbildung in Echtzeit zu beobachten. Darüber hinaus sind viele Komponenten großer Signaltransduktionswege in hohem Maße konserviert Diese Modellorganismen sind im Detail durch eine große Anzahl von Literatur charakterisiert worden. Der Hauptvorteil bei der Verwendung von Fröschen und Zebrafisch-Embryonen, um die Auswirkungen von Hypoxie auf die Wirbeltierentwicklung zu untersuchen, ist, dass alle Prozesse direkt überwacht werden können, da Sauerstoff schnell die Embryonen durchdringt. So, bei Fröschen und Zebrafisch, wie im Gegensatz zu anderen Modellorganismen wieMaus-Embryonen, kann der Einfluss einer spezifischen Sauerstoffkonzentration im interessierenden Gewebe untersucht werden, ohne die Anwesenheit oder den Mangel an funktionellem Gefäß zu berücksichtigen.

Die meisten handelsüblichen Aufbauten für die hypoxische Inkubation haben den Nachteil, dass sie vergleichsweise groß sind und entsprechend hohe Betriebskosten aufweisen. Abgesehen von ihrem hohen anfänglichen Kosten- und Gasverbrauch erfordert die Äquilibrierung und die Aufrechterhaltung gemeinsamer Hypoxie-Kammern die Aufrechterhaltung einer konstanten hypoxischen Atmosphäre gegen den Gasgradienten, der in diesen Kammern aufgrund ihrer größeren und / oder organischen Atmung natürlich vorkommt. Dies erfordert die Verwendung von Gasventilatoren und ein Kühlsystem, das die Menge an zusätzlichen notwendigen Geräten erhöht, die Geschicklichkeit des Forschers beeinträchtigt und insgesamt die Einfachheit des experimentellen Verfahrens verringert. Im Gegensatz dazu ist das hier präsentierte Setup vergleichsweise robust, aber sehr kostengünstig, klein, einfach zu ermitteln und erlaubt fAst Gas-Äquilibrierung, stabile hypoxische Atmosphäre und einfacher Austausch von Materialien und Lösungen in der Kammer. Unser System kann für den Einsatz mit jedem aquatischen Modell Organismus von Interesse eingesetzt werden.

Wir haben eine hypoxische Kammer konstruiert, die bequem klein ist und daher in einem gemeinsamen Laborinkubator platziert werden kann, was leicht experimentelle Eingriffe bei einer bestimmten Temperatur ermöglicht. Durch die bequeme Kontrolle der Temperatur sowie der Sauerstoffkonzentration im Medium liegt der Vorteil unseres Systems gegenüber den handelsüblichen Hypoxieinkubatoren in seiner geringen Größe und Kosteneffizienz. So kann unser Setup mit Hilfe von Laboratorien für die meisten Laboratorien eingerichtet werden und erfordert keine teuren Materialien. Darüber hinaus erzeugt unser Setup keine Hitze, im Gegensatz zu den handelsüblichen Hypoxie-Inkubatoren und ermöglicht die Verwendung bei Temperaturen unterhalb der Raumtemperatur in einem Inkubator. Das laSt ist besonders kritisch für die Arbeit mit kaltblütigen Organismen wie Frösche und Fische, wo Entwicklungs- und Stoffwechselraten stark temperaturabhängig sind.

Als sehr kostengünstig und leicht zu bauen ist unsere Gasinkubationskammer dennoch sehr vielseitig einsetzbar, um verschiedene hypoxische oder hyperoxische Zustände zu etablieren und eine schnelle und einfache Verabreichung unterschiedlicher Medien und Lösungen für eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen zu ermöglichen. Darüber hinaus ermöglicht unser System die Verwendung einer 24-Well-Platte anstelle von üblicherweise verwendeten Speisen oder Labortanks 10 , 11 , 12. Unser System ermöglicht die Beobachtung und experimentelle Behandlung von mehreren Mutantenbedingungen auf einmal.

Um die korrekte Induktion der Hypoxie zu kontrollieren, haben wir die Niveaus des HIF-1α-Proteins durch Western-Blot-Detektion überwacht. Darüber hinaus ist die Anzahl der proliferierenden Zellen vor und nach der InkubationN in der hypoxischen Kammer kann verwendet werden, um festzustellen, ob Hypoxie im Gewebe induziert worden ist. Diese Methode basiert auf unseren bisher veröffentlichten Ergebnissen 13 , die zeigen, dass die Proliferation in der embryonalen retinalen Stammzellnische bei der Induktion der Hypoxie abnimmt. So haben wir das Niveau der Retinal-Stammzell-Proliferation durch Zugabe von 5-Ethinyl-2'-desoxyuridin (EdU) zum Embryonemedium überwacht und deren Einarbeitung in die DNA von neu proliferierenden Zellen gemessen.

Protocol

Dieses Protokoll folgt den Tierschutzrichtlinien der Universität von Cambridge. 1. Tierpflege Frosch-Embryonen ANMERKUNG: Embryonen können entsprechend der Tier- und Laboreinrichtung angehoben und gepflegt werden. Hier wird ein Beispiel für die Tierpflege beschrieben. Vorbereitung der 0,1x modifizierten Barth-Lösung (MBS): 0,88 mM NaCl, 10 μM KCl, 24 μM NaHCO 3 , 100 μM HEPES, 8,2 μM MgSO 4 , 3,3 μM Ca (NO 3 ) 2 und …

Representative Results

Der Einsatz des hypoxischen Kammersystems, das wir hier vorstellen, erlaubt die Untersuchung der Wirkungen von Hypoxie einzeln und in vivo bei ganzen lebenden Tieren. Hypoxie kann durch die Platzierung von ganzen Frosch- oder Zebrafisch-Embryonen in die hypoxische Kammer induziert werden ( Abbildung 1 ) und wird bei verschiedenen Kombinationen von Bedingungen durchgeführt. Ein Bild unseres fertiggestellten Gaskammer-Aufbaus ist in <strong class="xf…

Discussion

Hier haben wir eine einfache, aber robuste neue Methode vorgestellt, um eine Hypoxie zu induzieren, die für den Einsatz mit Frosch- und Zebrafisch-Embryonen angepasst ist, aber auch für andere Wasserorganismen geeignet ist. Der wesentliche Vorteil dieser Methode liegt in ihrer Einfachheit und Kosteneffizienz. Dennoch sind die mit dieser Methode erzielten Ergebnisse sehr robust. Wir haben gezeigt, dass Hypoxie in der Kammer sowohl in ganzen Embryonen als auch in spezifischem Gewebe effizient induziert werden kann – hie…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt von der Unterstützung von Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z an WAH und dem DFG-Stipendium KH 376 / 1-1 an HK

Materials

Sodium chloride Sigma S7653 NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST
Potassium chloride Sigma P9333 KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu,
Sodium bicarbonate Sigma S5761 NaHCO3 / 0.1X MBS
HEPES Sigma H3375 0.1X MBS
Magnesium sulfate Sigma M7506 MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium
Calcium nitrate Sigma 202967 Ca (NO3)2 / 0.1X MBS
Calcium chloride Sigma C1016 CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium
Methylene blue Sigma M9140 Embryo medium
Pregnant mare serum gonadotropin Sigma CG10 frog fertilization
Zebrafish breeding tank Carolina 161937 gas chamber construction
24-well plate Thermo Scientific 142475 Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction
Epoxy resin RS Components UK Kit 199-1468
Gas distributor valve WPI Luer Valves Kit 14011 aquatic tank attachment (Schema 1, H)
High precision gas valve BOC  200 bar HiQ C106X/2B gas tank attachment (Schema 1, I)
5% oxygen and 95% N2 gas tank BOC 226686-L hypoxic gas mixture
ceramic disc diffuser CO2 Art  Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 Schema 1, J
silicone grease Scientific Laboratory Supplies VAC1100 Schema 1, K
oxymeter Oxford Optronix  Oxylite, CP/022/001 hypoxic chamber setup
fibre-optic dissolved oxygen sensor Oxford Optronix HL_BF/OT/E hypoxic chamber setup
plastic pasteur pipette Sterilin STS3855604D for embryo transfer
MS222  Sigma Aldrich E10521-50G embryo anesthetic
RIPA buffer  Sigma R0278-50ML tissue homogenization
Protease inhibitor Sigma P8340 tissue homogenization
Tris Sigma 77-86-1 4X Laemmli loading buffer, 10X TBST
Glycerol Sigma G5516 4X Laemmli loading buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma L3771 SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer
beta-Mercaptoethanol  Sigma M6250 4X Laemmli loading buffer
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 4X Laemmli loading buffer
Trizma base  Sigma 77-86-1 5X Running buffer, Transfer buffer
Glycine Sigma G8898 5X Running buffer, Transfer buffer
Methanol Sigma 34860 Transfer buffer
Tween 20 Sigma P2287-500ML 10X TBST
skim milk powder Sigma 70166 Blocking Solution
Eppendorf microcentrifuge tube Sigma T9661
tissue homogenizer Pellet Pestle Motor Kontes Z359971 tissue homogenization
pellet pestles Sigma Z359947-100EA tissue homogenization
precast 12% gel Biorad Mini-ProteinTGX, 456-1043 Western Blot
protein ladder Amersham Full-Range Rainbow ladder, RPN800E Western Blot
nitrocellulose membrane (0.45 µm) Biorad 162-0115 Western Blot
anti-HIF-1α antibody Abcam ab2185 Western Blot
anti-α-tubulin antibody Sigma T6074 Western Blot
goat anti-rabbit antibody Abcam ab6789 Western Blot
goat anti-mouse antibody Abcam ab97080 Western Blot
Pierce ECL 2 reagent  Thermo Scientific 80196 Western Blot
ECL films Hyperfilm GE Healthcare Amersham 28906837 Western Blot
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine   santa cruz CAS 61135-33-9 EdU, EdU incorporation
Phosphate-buffered Saline Oxoid BR0014G 1X PBS
Formaldehyde Thermo Scientific 28908 Fixation solution
Sucrose Fluka S/8600/60 Solution solution
Triton X-100 Sigma T9284-500ML PBST
Heat-inactivated Goat Serum Sigma G6767-100ml HIGS, Blocking solution (EdU incorporation)
4',6-diamidino-2-phenylindole  ThermoFisher Scientific D1306 DAPI, EdU incorporation
Dimethyl sulfoxide Molecular Probes C10338 DMSO, EdU incorporation
glass vial VWR 98178853 EdU incorporation analysis
Tissue-Plus optimal cutting temperature compound  Scigen 4563 embedding medium, EdU incorporation analysis
cryostat Jung Fridgocut 2800E Leica  CM3035S EdU incorporation analysis
microscope slides Super-Frost plus Menzel glass Thermo Scientific J1800AMNZ EdU incorporation analysis
EdU Click-iT chemistry kit Molecular Probes C10338 EdU incorporation analysis
FluorSave Calbiochem D00170200 mounting medium, EdU incorporation analysis
coverslips VWR ECN631-1575 EdU incorporation analysis
fluorescent microscope Nikon Eclipse 80i EdU incorporation analysis
confocal scanning microscope Olympus Fluoview FV1000 EdU incorporation analysis
Volocity software PerkinElmer Volocity 6.3 EdU incorporation analysis

References

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Khaliullina-Skultety, H., Zi Chao, N., Harris, W. A. Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (124), e55710, doi:10.3791/55710 (2017).

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