Qui presentiamo un protocollo Golgi-Cox in dettagli estesi. Questo metodo affidabile di macchie di tessuto consente una valutazione di alta qualità della cytoarchitettura nell'ippocampo, e in tutto il cervello, con una minima risoluzione dei problemi.
Le spline dendritiche sono le protuberanze degli alberi dendritici neuronali che contengono sinapsi eccitatoriali. Le variazioni morfologiche e ramificanti dei dendriti neuronali all'interno dell'ippocampo sono implicati nella formazione della cognizione e della memoria. Ci sono diversi approcci alla colorazione Golgi, tutti utili per determinare le caratteristiche morfologiche degli archi dendritici e produrre uno sfondo chiaro. L'attuale metodo Golgi-Cox, (una leggera variazione del protocollo fornito con un kit di colorazione Golgi commerciale), è stato progettato per valutare come una dose relativamente bassa del farmaco chemioterapico 5-flurouracil (5-Fu) avrebbe influenzato la morfologia dendritica , Il numero di spine e la complessità dell'arborizzazione all'interno dell'ippocampo. Il 5-Fu ha significativamente modulato la complessità dendritica e ha ridotto la densità della colonna vertebrale in tutto l'ippocampo in un modo specifico della regione. I dati presentati mostrano che il metodo di colorazione Golgi efHa colorato esattamente i neuroni maturi nel CA1, nel CA3 e nel dentato gyrus (DG) dell'ippocampo. Questo protocollo riporta i dettagli di ogni passaggio in modo che altri ricercatori possano affidare affidabilmente il tessuto in tutto il cervello con risultati di alta qualità e minima risoluzione dei problemi.
I dendriti sono la parte più grande dei neuroni che ricevono e trattano l'input presinaptico 1 . I loro processi dendritici hanno una geometria complessa, in cui i rami prossimi hanno un diametro maggiore rispetto ai rami distali. Come sviluppano i dendriti, formano diversi collegamenti con altri neuroni in un processo denominato arborizzazione dendritica. L'estensione e il modello di questa ramificazione determina la quantità di input sinaptici che un dendrite può elaborare adeguatamente 2 .
L'arborizzazione dendritica è un processo necessario per la plasticità dipendente dall'attività e lo sviluppo appropriato dei circuiti neuronali. L'estensione, la retrazione, la ramificazione e la sinaptogenesis sono processi intricati che includono programmi genetici intrinseci e influenze da fattori estrinseci. Le variazioni morfologiche e ramificanti dei dendriti neuronali all'interno dell'ippocampo sono implicati nella formazione della cognizione e della memoriaF "> 3 , 4. Le alterazioni della complessità dendritica sono associate a alterazioni fisiopatologiche e comportamentali 5. Le anomalie sono legate a diversi stati malattie, tra cui la sindrome del X fragile e la sindrome di Down 6 .
Le spine dendritiche sono gli scompartimenti subcellulari specializzati degli archi dendritici che ricevono entità eccitatorie all'interno del sistema nervoso centrale. Ci sono tre classi morfologiche di spine dendritiche, con il nome di ciascuna classe basata sulla loro dimensione e forma: 1) spine di funghi, che hanno densità postinaptica complesse con più recettori di glutammato rispetto alle altre spine 7 ; 2) spine stubby, che non hanno uno stelo; E 3) spine sottili, che sono costituite da uno stelo protratto e stretto e da una testa a globo 8 . Il volume della spina dendritica viene utilizzato in parte per definirli, con spine sottili generalmente più piccole (0.01 μm 3 </sup>) Rispetto alle spine di funghi (0,8 μm 3 ) 9 , 10 . Le spine si stabilizzano con la maturazione. Ad esempio, le spine sottili ritirarsi dopo pochi giorni o svilupparsi in spine fungine. In alternativa, le spine del fungo sono relativamente stabili e possono sopravvivere per un lungo periodo di tempo. La forza delle connessioni neuronali si basa sul numero di spine e / o sul loro volume 11 , 12 , 13 .
Il classico metodo di colorazione Golgi e le sue variazioni più moderne sono state utili per esaminare la morfologia e la densità della spina dendritica. Un aspetto unico della colorazione Golgi è che macchia casualmente circa il 5% dei neuroni totali, che permette la traccia dei singoli neuroni 14 , 15 . Anche se l'esatto meccanismo in cui il metodo GolgiOd di macchie di singoli neuroni è ancora sconosciuto, il principio del metodo è basato sulla cristallizzazione del cromato d'argento (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . Ci sono tre tipi principali del metodo Golgi: il Golgi rapido, il Golgi-Cox e il Golgi-Kopsch 18 , 19 . Tutti e tre i metodi iniziano con una fase iniziale di incubazione nei sali di cromo per diversi giorni a mesi, ma esistono alcune differenze fondamentali tra loro. Il rapido Golgi usa il tetroxido di osmium nel primo passaggio, mentre il Golgi-Kopsch include la paraformaldeide. La colorazione sia nel rapido Golgi che nel Golgi-Kopsch è seguita da un'incubazione in soluzione nitrato d'argento 1-2% per circa 7 giorni. Il metodo Golgi-Cox utilizza il cloruro di mercurio e il bicromato di potassio anziché il nitrato d'argento e ha un tempo di impregnazione di 2-4 settimane. I tessuti vengono quindi sezionati e posizionati rapidamente in una ammoniaca diluitaSoluzione, seguita da un fissatore fotografico per rimuovere sali. Tra i tre tipi, il metodo Golgi-Cox è considerato il più adatto alla colorazione degli archi dendritici senza molte interferenze di fondo, in parte perché gli artefatti cristallini non si verificano sulla superficie del tessuto (a differenza del metodo rapido Golgi) 17 , 20 , 21 .
Il metodo presente è una leggera variazione del protocollo fornito con un kit di colorazione commerciale Golgi ed è stato progettato per valutare come una dose relativamente bassa del 5-Fu influenzerebbe le caratteristiche morfologiche dendritiche e la densità della colonna vertebrale. Tutti i dati acquisiti potrebbero fornire ulteriori informazioni sul modo in cui il trattamento chemioterapico influenza la circuiteria neuronale.
Rispetto alle tecniche più moderne, il metodo Golgi-Cox presenta diversi vantaggi che lo rendono il metodo preferito per esaminare la morfologia della colonna vertebrale: 1) la colorazione può essere utilizzata per qualsiasi tessuto, 2) una messa a punto di microscopi di base è tutto ciò che serve a Acquisire immagini basate su Golgi, 3) l'imaging Golgi-Cox è più veloce di un'immagine confocale e 4) le sezioni macchiate di Golgi sono vitali per diversi mesi a anni più a lungo dei campioni che sono etichet…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione pilota sotto NIH P20 GM109005 (ARA) e dal Centro per il Premio Programma IDeA P30 GM110702 per il Trasferimento Neuroscienze.
superGolgi Kit | Bioenno Lifesciences | 30100 | Contains hazardous materials. |
PBS 10X powder concentrate | Fisher | BP665-1 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
Permount | Fisher | SP 15-100 | |
Slide cover | Fisher | 12-546-14 | |
7mL Transfer pipette | Globe Scientific | 135030 | |
10 mL Falcon tubes | BD Biosciences | 352099 | |
Foil | Fisher | 01-213-105 | |
12-well plate | BD Biosciences | 353043 | |
200 proof Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
Xylene | Acros Organics | 1330-20-7 | Hazardous. |
Permabond 200 | Permabond LLC | GF2492 | |
25 mL serological pipette | Sigma | SIAL1489 | |
Parafilm | Midsci | HS234526C | |
Vibratome | World Precision Instruments | NVSLM1 | |
C57Bl/6 Male Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
Axio Imager 2 | ZEISS | Multiple components, see website for details. | |
AxioCam MRc Camera | ZEISS | 426508-9902-000 | |
Staining Dish , Green | Tissue-Tek | 62541-12 | |
Staining Dish Set | Electron Microscopy Sciences | 70312-20 | |
Motorized Pipet Filler | Fisher | 03-692-168 | |
Neurolucida | mbf Bioscience | ||
Neurolucida Explorer | mbf Bioscience | ||
Prism | GraphPad |