結膜から細胞を単離して表現する非侵襲的方法
Summary
露出した正常眼球表面は、角膜および結膜からなる。上皮細胞、杯細胞および免疫細胞が結膜内に存在する。ここでは、非侵襲的な印象細胞学の技術が印象細胞学装置とフローサイトメトリーを用いて結膜内の免疫細胞を分析することが記載されている。
Abstract
伝統的に、眼表面細胞学は、スパチュラ技術およびブラシ技術などの技術を用いて研究されている。これらの技術の問題点は、眼の表面に外傷性の病変を誘発し、瘢痕化、眼瞼変形、角膜幹細胞欠損症に進行し、場合によっては被験者に大きな不快感を引き起こす可能性があることである。これらの臨床上の問題を回避するために、乾性眼疾患およびその後の新形成、アトピー性疾患、春季角結膜炎および乾性角結膜炎を診断するための印象細胞学（IC）が開発された。典型的には、臨床医は手動で濾紙を必要な形状に切断し、これらを眼の表面に適用する。ここでは、市販の医療機器を使用してICを実行する方法について説明します。この技術は、フローサイトメトリーによる免疫表現型解析の後に続いて説明される。この技法は、手作業の取り扱いが少なくて済み、眼表面の損傷をより少なくする。
Introduction
印象細胞学（IC）は1977年にThatcher et al 。彼らは、スクラップ、拭き取り、またはピペッティングなど、その時に利用可能な他の技術の代わりに、患者から結膜細胞を収集するためにプラスチック印象ディスクを使用した1 。 ICの現在の技術は、吸収性濾紙2を用いて球膜および眼瞼結膜を刻印し、結膜細胞の最も表面の層を集める。分化の最終段階に達したこれらの細胞は、連続して涙を流す3 。上皮細胞4 、杯細胞3,5 、および粘膜関連リンパ組織（上皮関連エフェクターT細胞または樹状細胞6）の 3つの主要な細胞集団がIC標本に見出される。 ICSAMにおける眼球表面細胞プレートは、顕微鏡検査、免疫ブロッティングおよび逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR） 7によって分析することができる。最近、ICメンブレン8を擦って集めた免疫細胞の解析にフローサイトメトリーが使用されています。興味深いことに、IC 6,9は、乾性角結膜炎、ビタミンA欠乏症、瘢痕性食細胞性アポトーシス、アトピー性疾患、上肢角結膜炎、春季角結膜炎および上皮性扁平上皮化生を含む多くの眼表面疾患の評価に使用されている。 ICはまた、コンタクトレンズの装着、眼球表面の微生物の検出、および縦走試験10,11,12における治療的介入の治療有効性および耐性の試験の影響を評価するために使用されている。
医療機器（EyePrim）は、ポリフローサイトメトリー（OSIC-フロー）による眼の印象細胞学の技術について以前に検証されており、縦走サンプリングを使用して疾患の進行および処置に対する応答（ 例えば 、詳細粘膜膜類天疱瘡における進行性結膜線維症の推定上の疾患マーカーとして定義される上皮内白血球の分析） 13 。初期の研究者は、手動印象を必要とするオートクレーブされたPESフィルターを使用した。その結果、利回りは変動し、ユーザーに依存していました。この医療用具の利点は、使いやすさ、標準化圧力（PaまたはN / m 2 ）であり、再現性、再現性および一貫した細胞回復を可能にする。この技術は外科手術ではなく、容易に実施でき、迅速であるため、外来診療所で有用である。これは、指令93/42 / CEE、CE 0499（SNCH）に従ったクラスI（無菌）医療機器です。必要なのは眼球表面の完全性の維持を確実にする処置中の局所麻酔である。 ICに続いて、細胞をフローサイトメトリーのために直ちに処理することができる。さらに、非眼科技術者および看護師が眼表面をサンプリングするように訓練されることが可能である。
他の技術に対するICの改善にもかかわらず、いくつかの課題が残っている。例えば、ICの位置に応じて、サンプリング領域および眼球結膜における地域差に起因する変動が存在し得る。変動の別の原因は、IC中に異なる量の圧力を印加することによるものである。その他の方法論的問題には、細胞処理の標準化が含まれる：これらには、持続期間および固定方法、およびサンプリングされた材料の安定性に影響を与える可能性のある貯蔵条件が含まれる。
この技術の全体的な目標は、眼の印象サンプルの分離方法を開発することである。tは使いやすく、非侵襲性であり、臨床サンプルの免疫学的特徴付けに適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
これは、スクレイピング、拭き取り、ピペッティングまたは吸収性濾紙1,2のような従来の技術とは対照的に、比較的迅速な免疫プロファイリングのために外来診療所で使用することができる、簡単で迅速かつ侵襲性の低い技術である。この技術の変種はすでに研究セッティング22で使用されています。提案された方法論の将来の適用は、眼疾患、特に免疫表現型検査を必要とする臨床試験における患者層別化である。
この技術の主な課題は、印象採取および掻爬後に回収される比較的少ない免疫細胞である。個体当たり4回のインプレッションから回収されたCD3 + T細胞の総数は、約500〜1,000個の細胞から変動した。眼球試料をフローサイトメトリー分析の前に最小限の回数洗浄して、さらなる細胞喪失を回避したs。プロトコール内に残る重要なステップおよび課題は、より高い細胞数を達成するために、眼球サンプルの効率的な収集および膜の適切な掻爬である。それにもかかわらず、この制限は特定の免疫表現型に偏っているとは考えにくい。細胞の収率を最大にするためにここで行われたトラブルシューティングは、抗体のインキュベーションの前後の洗浄工程の数を減らすことであった。
ICの使用には他の制限があります。スティーブンジョンソン症候群のような重度の角質化または線維化した眼球表面を有する患者では、細胞収量は本研究のそれよりも少なくてもよい。免疫細胞の割合は、試料が同じ日に分析される代わりに保存される場合に変化し得る。ある種の細胞型が他の細胞型よりも貯蔵に耐性があるかどうかを予測することは困難である。以前の研究では、結膜上皮細胞におけるHLA-DR発現レベルの上昇が報告されているため、HLA-DRと特異的免疫細胞のレベルとの間の相関を評価するために評価した。免疫細胞はまた、ケモカインの発現レベルと関連し得る。これらの問題は今後の研究で取り上げられるべきである。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は技術的なステップを支援してくれたNandini NallappanとSharon Yeoに感謝したいと思います。この研究は、Lee Kong Chian School of Medicine、Nanyang Technological UniversityからのKGCへのスタートアップグラント、シンガポール保健省のNational Medical Research Council（NMRC）からLT（NMRC / CSA / 045/2012）およびNMRCの助成金により、KGCおよびLT（NHIC-12D-1409007）に国立衛生イノベーションセンターによって管理されている。
Materials
| Reagents | |||
| anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
| anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
| anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
| 7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
| anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
| Pippetes | Eppendorf | NA | |
| Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
| Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Keratograph 5M | Oculus | NA | |
| Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
| EyePrim | Opia Technologies | NA | |
| FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
| FACSVerse analysis software | BD | NA |
References
- Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. Conjunctival impression cytology. Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84 (6), 798-801 (1977).
- Baudouin, C. The pathology of dry eye. Surv Ophthalmol. 45, S211-S220 (2001).
- Nelson, J. D., Wright, J. C. Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease. Arch Ophthalmol. 102 (7), 1049-1051 (1984).
- Brignole, F., et al. Expression of Fas-Fas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium. Positive correlation with class II HLA DR expression in inflammatory ocular surface disorders. Exp Eye Res. 67 (6), 687-697 (1998).
- Knop, E., Knop, N. The role of eye-associated lymphoid tissue in corneal immune protection. J Anat. 206 (3), 271-285 (2005).
- Lopez-Miguel, A., Gutierrez-Gutierrez, S., Garcia-Vazquez, C., Enriquez-de-Salamanca, A. RNA Collection From Human Conjunctival Epithelial Cells Obtained With a New Device for Impression Cytology. Cornea. 36 (1), 59-63 (2017).
- Tomlins, P., Roy, P., Cunow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival impression for Flow Cytometry. Invest Opthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Barros Jde, N., Almeida, S. R., Lowen, M. S., Cunha, M. C., Gomes, J. A. Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article. Arq Bras Oftalmol. 78 (2), 126-132 (2015).
- Calonge, M., et al. Impression cytology of the ocular surface: a review. Exp Eye Res. 78 (3), 457-472 (2004).
- Haller-Schober, E. M., et al. Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome. Eye (Lond). 20 (8), 927-933 (2006).
- Singh, R., Joseph, A., Umapathy, T., Tint, N. L., Dua, H. S. Impression cytology of the ocular surface. Br J Ophthalmol. 89 (12), 1655-1659 (2005).
- Williams, G. P., et al. Conjunctival Neutrophils Predict Progressive Scarring in Ocular Mucous Membrane Pemphigoid. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).
- Best, N., Drury, L., Wolffsohn, J. S. Clinical evaluation of the Oculus Keratograph. Cont Lens Anterior Eye. 35 (4), 171-174 (2012).
- Downie, L. E., Keller, P. R., Vingrys, A. J. Assessing ocular bulbar redness: a comparison of methods. Ophthalmic Physiol Opt. 36 (2), 132-139 (2016).
- Amparo, F., Wang, H., Emami-Naeini, P., Karimian, P., Dana, R. The Ocular Redness Index: a novel automated method for measuring ocular injection. Investigative ophthalmology & visual science. 54 (7), 4821-4826 (2013).
- Shapiro, A., Merin, S. Schirmer test and break-up time of tear film in normal subjects. American journal of ophthalmology. 88 (4), 752-757 (1979).
- Finis, D., Pischel, N., Konig, C., Hayajneh, J., Borrelli, M., Schrader, S., Geerling, G. Comparison of the OSDI and SPEED questionnaires for the evaluation of dry eye disease in clinical routine. Ophthalmologe. 111 (11), 1050-1056 (2014).
- Behrens, A. Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations. Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).
- Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells. Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).
- Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease. Sci Rep. 7, 45312 (2017).
- Williams, G. P., et al. The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases. Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).
- Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis. Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).
