La neuraminidasa Ensayo de inhibición basado en la fluorescencia para evaluar la susceptibilidad de los virus de la influenza a El Inhibidor de la neuraminidasa clase de antivirales

1. Determinación del rango lineal del producto fluorescente 4-MU en un fluorómetro Preparar 10 ml de mM 4-MU solución madre de 6,4 disolviendo 11,3 mg de 4-MU en 5 ml de etanol absoluto. Añadir 5 ml de NaCl al 0,9% (w / v) a la solución madre para hacer 10 ml. Preparar una 640? M de solución de trabajo diluyendo 1 ml de 6,4 mM 4-MU en 9 ml de 1x tampón de ensayo (ácido 33,3 mM de ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico (MES) y CaCl2 4 mM, pH 6,5). NOTA: Preparar el tampón de ensayo 2x mediante la adición de 13 g de MES y 8 ml de 1 M CaCl2 para 992 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 6,5 ​​usando 10 M de NaOH. Filtrar el tampón utilizando un filtro de acetato de celulosa estéril de tamaño de poro 0,2 m. ¡Precaución! El hidróxido de sodio es cáustico y puede causar quemaduras químicas en la piel y los ojos. Asegúrese de que el equipo de protección personal completo está desgastado. Preparar 5 ml de una gama de concentraciones de 4-MU (es decir, 5? M, 10? M, 20? M, 40? M, 80? M, 160 & #181; M, y 320? M) a través de una dilución en serie de dos veces de 640? M 4-MU usando tampón de ensayo 1x. Dispensar 50 l de cada dilución en serie de 4-MU (es decir, 5? M, 10? M, 20? M, 40? M, 80? M, 160? M, 320? M y 640? M) (dos pocillos por dilución) en un claro, 96- así placa de fondo plano y 50! l de tampón de ensayo 1x en los pocillos restantes (que sirven como espacios en blanco para medir señales de fondo). NOTA: Las concentraciones finales de 4-MU en el volumen de reacción (50! L 4-MU + 50! L 300 mM Munana) son 2,5 M, 5 M, 10? M, 20? M, 40? M, 80? M, 160? M y 320? M . Preparar una mM MUNANA solución madre de 2,5 mediante la reconstitución de 25 mg de Munana en 20 ml de agua destilada. Mezclar 0,72 ml de Munana 2,5 mM con 5,28 ml de 1x tampón de ensayo para obtener un 300? M Munana solución de trabajo (volumen suficiente para una placa). Cubrir el tubo que contiene la Munana workin 300 Mg de solución con papel de aluminio y mantenerlo en hielo si no se utiliza inmediatamente. Descarte cualquier materiales sobrantes. NOTA: El mM MUNANA solución madre de 2,5 se puede almacenar a -20 ° C durante 1 mes y debe ser utilizado dentro del ciclo / descongelación uno congelación. Las 4-MU soluciones y Munana son sensibles a la luz y deben ser protegidos de la exposición a la luz prolongado. Añadir 50 l de 300 Munana M a cada pocillo, golpee suavemente para mezclar, y se incuba a 37 ° C durante 30 min. Cubrir la placa con un sellador de placas para evitar la evaporación. NOTA: Este paso es para tener en cuenta la fluorescencia de fondo en el ensayo de inhibición de NA. Preparar la solución de parada mediante la mezcla de 11 ml de etanol absoluto con 2,225 ml de NaOH 0,824 M (volumen suficiente para una placa). Añadir 100! L de solución de parada a cada pocillo para detener la reacción y golpear suavemente para mezclar. Leer la placa usando un fluorómetro con un ajuste de longitud de onda de excitación de 355 nm y un ajuste de longitud de onda de emisión de 460 nm, como per las instrucciones del fabricante. Calcular la media de la señal de fondo usando señales de fluorescencia de todos los pocillos que no contienen 4-MU. Restar esta señal media de fondo de cada uno de los pocillos que contienen 4-MU y calcular las señales de promedio (RFU) para cada concentración de 4-MU. Trazar una curva estándar de RFU frente a la concentración de 4-MU (M), como se muestra en la Figura 1a; una sección lineal de primer plano de la curva se muestra en la Figura 1b. Visualizar la trama de RFU contra 4-MU concentración (M) para determinar el intervalo lineal y la señal objetivo óptimo; el intervalo lineal es donde la señal de fluorescencia aumenta en proporción al aumento de las concentraciones de la 4-MU en el terreno, mientras que la señal objetivo óptimo es una concentración de 4-MU arbitrario dentro del rango lineal. NOTA: El intervalo lineal y la señal objetivo óptimo son-fluorómetro específico. Por ejemplo, el fluorómetro en el Melbourne WHOCCRRI tiene un rango lineal de 20,5 a 40? M 4-MU y una señal objetivo óptimo de ~ 30? M 4-MU, que corresponde a ~ 1.500 RFU. 2. La determinación de la actividad de NA de los virus NOTA: Los virus de influenza son cultivadas a títulos suficientes en Madin-Darby Canine Kidney células (MDCK) o huevos de pollo embrionados 8. Dispensar 120 l por pocillo de virus de influenza en cultivo sin diluir en la columna 1 y 60! L de tampón de ensayo 1x que contienen 0,1% de NP-40 en las 11 columnas restantes de un de 96 pocillos, la placa de fondo en U. En serie realizar dilución de dos veces de los virus a través de la placa (es decir, la transferencia de 60! L de la columna 1 a la columna 2 y así sucesivamente, hasta la columna 11) usando una pipeta multicanal, sale de la columna 12 como un blanco que contiene tampón de ensayo solamente 1x. Transferir 50! L de cada uno de los pocillos (virus y espacios en blanco diluido) en un 96 pocillos, la placa transparente, de fondo plano. NOTA: No es necesario cconsejos hange pipeta si los materiales se transfieren desde la columna 12 a través de a la columna 1. Añadir 50 l de 300 mM Munana (preparado como en la etapa 1.4) por pocillo y golpear suavemente la placa para mezclar. Incubar la placa a 37 ° C durante 1 h. Cubrir la placa con un sellador de placas para evitar la evaporación. Añadir 100! L de solución de parada (preparado como en la etapa 1.6) por pocillo para terminar la reacción y golpear suavemente la placa para mezclar. Leer la placa usando un fluorómetro. Utilice un ajuste de la longitud de onda de excitación de 355 nm y un ajuste de la longitud de onda de emisión de 460 nm. Determinar la señal de fondo promedio basado en las lecturas de fluorescencia de la columna 12 y restar la señal de fondo promedio de cada pocillo. Trazar un gráfico de RFU frente a diluciones de virus. NOTA: Los valores de fondo para 100 Munana M en el WHOCCRRI Melbourne son típicamente entre 50 y 120 RFU, pero estos serán diferentes dependiendo de la bei fluorómetrong utiliza. Ver la trama de RFU contra diluciones de virus para determinar el punto medio de la sección lineal de la curva para cada virus (Figura 2). Utilice la señal objetivo óptimo (determinado en el paso 1) como el punto de referencia. NOTA: Este debe corresponder con el intervalo lineal 4-MU del fluorómetro determina en el apartado 1 y proporcionará la concentración apropiada de virus para ser utilizado en la sección 3. 3. Estimación de la susceptibilidad Virus de NA inhibidores usando el Ensayo de inhibición de NA Preparar lotes maestros de inhibidores de NA a concentraciones de 300? M. Preparar 300 M zanamivir (peso molecular, PM = 332,32 g / mol) por disolución de 5,0 mg de zanamivir en tampón de ensayo 50 ml de 2x (MES 66,6 mM y 8 mM de CaCl2, pH 6,5). Preparar 300 M carboxilato de oseltamivir (D-tartrato; PM = 386,44 g / mol) por disolución de 5,8 mg en 50 ml de tampón de ensayo 2X. Preparar300? M peramivir trihidrato (PM = 382,45 g / mol) por disolución de 5,7 mg en 50 ml de tampón de ensayo 2X. Preparar 300 M Laninamivir (PM = 346,34 g / mol) por disolución de 5,2 mg en 50 ml de tampón de ensayo 2X. NOTA: Los lotes maestros de inhibidor de NA se pueden almacenar a -20 ° C durante 12 meses. Compruebe el MW de los inhibidores de NA para asegurar los pesos y volúmenes correctos se utilizan en la reconstitución. El carboxilato de oseltamivir es el compuesto activo del fosfato profármaco oseltamivir. Por lo tanto, sólo el carboxilato de oseltamivir se debe utilizar en el ensayo de inhibición de NA. A partir de los lotes maestros, preparar stocks de diez veces diluciones en serie de los inhibidores de NA en 50 tubos de centrífuga mL trabajar a concentraciones de 0,03 nM, 0,3 nM, 3 nM, 30 nM, 300 nM, 3000 nM, y 30.000 nM en el ensayo de 2x tampón (MES 66,6 mM y 8 mM de CaCl2, pH 6,5); esto es para uso a través de múltiples ensayos. NOTA: Las concentraciones finales de inhibidores de NA en la volum reaccióne (50? l de dilución de virus + 50 l de NA inhibidor + 50 l de 300 Munana M) son 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM, y 10 000 nM, respectivamente. La concentración final no incluye los 100 l de solución de parada. Almacenar todos los inhibidores de diluciones de NA a 2-8 ° C. La fecha de caducidad es el mismo que el de los lotes maestros. Preparar las diluciones de virus en tampón de ensayo 1x que contienen 0,1% de NP-40 tensioactivo en un bloque de 96 pocillos profundos. El uso de diluciones de virus a partir de los resultados del ensayo de actividad de NA derivados de la sección 2. Utilizar un volumen total de 2 ml por virus para probar cuatro inhibidores de NA. NOTA: Preparar dos pozos (1 ml por pocillo) por virus en un bloque de 96 pocillos profundos. Ejemplos de diluciones de virus para el virus de 1, 2, y 3 se muestran en la Tabla 1. Dispensar el volumen requerido de inhibidores de la NA (preparado como en la etapa 3.2) en un depósito 8 de pozo profundo. A partir de ahí, dispensar 50 l de inhibidores de la NA a diluciones que varían de 0 nM (2x ensayo bsolamente Uffer) a 30.000 nM en las filas A a H en una de 96 pocillos, la placa transparente, de fondo plano. NOTA: La disposición de la placa se ilustra en la Figura 3. Añadir 50 l de virus de ensayo diluidos por pocillo a las columnas 1-11 y 50 l por pocillo de tampón de ensayo 1x solamente a la columna 12. Golpear suavemente la placa para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 45 min. Cubrir la placa con un sellador de placas para evitar la evaporación. Añadir 50 l de 300 mM Munana (preparado como en la etapa 1.4) por pocillo y golpear suavemente la placa para mezclar. Incubar la placa a 37 ° C durante 1 h. Cubrir la placa con un sellador de placas para evitar la evaporación. Añadir 100! L de solución de parada (preparado como en la etapa 1.6) a cada pocillo y golpear suavemente la placa para mezclar. Leer la placa usando un fluorómetro. Utilice una longitud de onda de excitación de 355 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm, como se describe anteriormente. 4. Cálculo deLos valores de CI50 NOTA: El v1.2 JASPR es un software de ajuste de curvas que permite el cálculo de los valores de CI50. El software fue desarrollado por la División de Influenza de los CDC, Atlanta, EE.UU.. El software utiliza la ecuación: V = V max x (1 – ([I] / (K i + [I]))), donde V max es la tasa máxima de metabolismo, [I] es la concentración de inhibidor, V es la respuesta se inhibió, y K i es el IC 50 para la curva de inhibición. Copiar y pegar los datos en bruto que salen de la fluorómetro en una hoja de cálculo en un formato de placa de 12 columna (96 pocillos), a partir de la celda A1. NOTA: Raw datos de cada placa posterior debe ser escalonada por una fila vacía. Si cada virus ha sido probado contra cuatro inhibidores de la NA, pegar los datos en bruto en un conjunto de cuatro (con una fila vacía entre cada placa). Abra el software de adaptación y click en la pestaña "Experimento". Elija "alternativos 2-fármaco Fluoro 11 muestras." Haga clic en la pestaña "Opciones" y marca "generar gráficos." Haga clic en "Opciones" de nuevo y haga clic en la pestaña "Nueva clave". Guarde el archivo .csv "inhibition_key" en la misma carpeta que el archivo de la hoja de datos en bruto. En el archivo inhibition_key, listar todos los nombres de las muestras por debajo de la ID. Cada nombre de la muestra debe ser único. Si se probaron cuatro inhibidores de la NA, insertar espacios para dos filas adicionales a continuación Oseltamivir y el tipo de "Peramivir" y "Laninamivir." Guardar los cambios realizados en el archivo inhibition_key. Volver a la "jaspr v 1.2-Inhibición Ajuste de curvas" de la ventana y seleccione el archivo de datos brutos como el "Experimento Archivo" y inhibition_key como el "archivo de clave." Ejecutar el análisis. Guardar los resultados en formatos .csv y .pdf. Nota: El software trazará automáticamente una curva de inhibición (RFU agaiNST NA concentraciones de inhibidor), como se muestra en la Figura 4. El programa también calcula los valores de IC50 para cada virus frente a un particular inhibidor de NA (Figura 4). Además, JASPR presenta los valores de CI 50 y el fondo de señal a (S / B) relación en formato de hoja de cálculo. Los valores de fondo pueden diferir de un laboratorio a otro dependiendo del fluorómetro usado. Al Melbourne WHOCCRRI, el fondo valora para la gama Munana 100? M de 50 a 120 RFU. Para un valor fiable IC 50, se prefiere una relación de S / B de ≥10, aunque una proporción de menos de 10 es todavía aceptable, en particular para los virus mutantes que tienen una actividad muy baja NA. Inspeccionar los valores de IC50 y las formas de las curvas generadas por el software. Todos los puntos de datos deben caer sobre o cerca de la curva; si no lo hacen, repetir el ensayo de inhibición de NA. NOTA: Para los virus que muestran inusualmente altos valores de CI 50, el ensayo debe ser de repeticióned para confirmar el resultado.