알파 - 시누 클레인 브릴의 주변 접종 후 형질 전환 마우스의 신경 염증의 생물 발광 영상
Summary
(+/- M83 : GFAP의 -luc +/-)의 Tg는 복막 내로 또는 혀의 α- 시누 클레인 브릴의 말초 주입 가족적 A53T 돌연변이와 반딧불이 루시퍼 라제와 인간의 α- 시누 클레인 표현 마우스, 신경 염증을 포함한 신경 병리학을 유도 할 그들의 중추 신경계한다.
Abstract
잘못 접힌 알파 – 시누 클레인의 프리온 같은 동작을 연구하기 위해 마우스 모델은 중추 신경계 (CNS)에서 신경 병리학을 일으킬 알파 – 시누 클레인의 prionoids의 빠르고 간단하게 전송을 허용하는 것이 필요하다. 마우스, 프리온 단백질 프로모터로부터 A53T 돌연변이와 인간의 α- 시누 클레인 과발현과 반딧불에서 루시퍼 : 여기에서는 bigenic의 Tg (GFAP의 -luc +/- M83 +/-)으로의 α- 시누 클레인 브릴의 intraglossal 또는 복강 내 주사를 설명 글 리아 섬유 성 산성 단백질 프로모터 (GFAP), 신경 병리학 적 질환을 유발하기에 충분하다. 동물 그들이 도달 할 때까지 자연 질환 무료 남아 8 개월 이형의 Tg (GFAP의 -luc +/- M83 +/-)의 나이에 시작 심한 신경 학적 증상이 동형 접합의 Tg (M83 + / +) 마우스와 비교 22개월의 나이. 흥미롭게 intraperitone 통해 알파 시누 클레인 브릴 주입229 ± 십칠일의 중간 배양 시간과 마우스 : 알 경로가 다섯의 Tg (GFAP의 -luc +/- M83 +/-) 네 마비와 신경 학적 질병을 유발. 병에 걸린 동물은 뇌와 척수에서 인산화 된 알파 – 시누 클레인의 심각한 예금을 보였다. 알파 시누 클레인의 축적은 sarkosyl 불용성이었고 유비퀴틴과 P62와 colocalized 및 성상 신경교 증 및 microgliosis 결과 염증 반응을 수반 하였다. 놀랍게도, 혀에 알파 – 시누 클레인 원 섬유의 접종 285 일 후에 알파 – 시누 클레인 병리를 보여주는 다섯 주입 동물의 한으로 질병을 일으키는 덜 효과적이었다. 우리의 연구 결과는 (+/- M83을 : GFAP의 -luc를 +/-) 복강 내 경로를 통해 intraglossal 노선과 더욱 그렇다 통해 접종의 Tg에 synucleinopathies의 관련 특징과 신경 학적 질병을 유도하기 적합하다는 것을 보여 쥐를. 이 유도 프리온 같은 기전 연구를위한 새로운 모델을 제공합니다보다 상세히의 α- 시누 클레인의 prionoids d 개의.
Introduction
알파 – 시누 클레인은 특히 자기 씨앗 용량에, 프리온 단백질의 것과 유사 세포 사이의 연결 경로를 따라 미스 폴딩을 전파 특성을 가지고 성장 증거가있다. 알파 – 시누 클레인의이 속성은 '프리온 같은'또는 'prionoid'라고, 새로 건강한 뉴런 1, 2를 이식하는 병에 걸린 뉴런에서 잘못 접힌 알파 – 시누 클레인의 전달률을 제안 이식 실험에서 관찰에 의해 지원됩니다 3, 4. 또한 뇌 또는 주변부, 예 뒷다리 근육이나 장벽의 말단 부분의 α- 시누 클레인 병리의 확산의 결과로 잘못 폴딩의 α- 시누 클레인의 직접 분사 CNS의 5, 6, 7, <SUP 클래스 = "외부 참조"> 8, 9, 10. 우리는 더 상세히 주변 경로를 통해 알파 시누 클레인의 prionoids의 송신을 분석 미스 폴딩의 α- 시누 클레인은 단일 intraglossal 또는 복강 내 주사 한 후 이전 프리온 위해 아니라 잘못 폴딩 알파 위해 도시되었던 기능을 CNS를 neuroinvade 수 있는지 질문을 해결 시누 클레인. 혀에 프리온 주입 후 CNS의 neuroinvasion는 뇌간 (11)에있는 설하 신경의 핵 리드 혀 설하 신경을 따라 전달을 통해 달성된다. 하여 성상 세포의 활성화를 모니터 프리온 프로모터, 인간의 α- 시누 클레인의 A53T 변이체를 과발현하고 반딧불이 GFAP 프로모터의 제어 하에서 루시페라아제 마우스 : 마우스 모델로 우리의 Tg (GFAP의 -luc +/- M83를 +/-) 선택한 생물 발광, 이전의 뇌에서와 같이쥐 12 프리온은 감염. 우리의 손에 bigenic의 Tg (M83 +/- : GFAP의 -luc +/-) 다른 사람 (13)에 의해 도시 된 바와 같이 마우스는 시대의 23개월까지 질병을 개발하지 않았다. 뇌에서 병리학, Tg 및 척수와 intraglossal 또는 복강 내 경로 유도 된 신경 질환을 통해 인간의 α- 시누 클레인 브릴의 단일 주입 : 가설을지지 생쥐 (+/- +/- M83 GFAP의 -luc) 알파 – 시누 클레인의 prionoids 프리온 (14)와 중요한 특성을 공유합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tg는 (M83 +/- : GFAP의 -luc +/-)의 복막 내로의 α- 시누 클레인 브릴의 말초 주입 마우스 synucleinopathies의 중요한 특성 요점을 되풀이하는 신경 염증을 동반 신경 질환을 유발하는 용이 한 방법을 나타낸다. 마찬가지로, 혀 주입 트랜스 제닉 마우스에서의 α- 시누 클레인의 prionoids 의해 neuroinvasion 대한 다른 경로를 나타내고 있지만, 덜 효율적이다. 우리는 주사 후 420일에서 실험을…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 올가 샤르마, 테레사 헌트 및 기술 지원에 대한 DZNE 현미경과 동물 시설의 직원을 감사드립니다.
Materials
| anti-actin antibody | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anti-GFAP antibody | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| anti-Sequestosome-1 (p62) antibody | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anti-ubiquitin antibody [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamine | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xylazine | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| 27-gauge syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II imaging system | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | TLA-110 rotor | |
| Thickwall polycarbonate tubes | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP conjugated antibody | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 conjugated antibody | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 imaging system | Raytest | ||
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | SA/00216763/000500 | working solution 3% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | working dilution 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | ||
| HALT protease and phosphatase inhibitors | Thermo Fisher Scientific | 10516495 | |
| Precellys 24-Dual homogenizer | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtome RM2255 | Leica | ||
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss |
References
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