Transcriptoom analyse<em> C</em>.<em> elegans</em> RNA Sequencing gegevens via de Tuxedo Suite op de Galaxy Project

De eerste sequentiebepaling van het menselijk genoom, uitgevoerd met behulp van Fred Sanger dideoxynucleotide-sequencing methode, duurde 10 jaar en kostte naar schatting 3 miljard US $ ^{1, 2.} Echter, in iets meer dan een decennium sinds haar oprichting, Next-Generation Sequencing (NGS) technologie heeft het mogelijk gemaakt om het gehele menselijke genoom binnen twee weken en voor US $ 1.000. New NGS instrumenten die het mogelijk maken steeds grotere snelheid van verzamelen sequencing-data met een ongelooflijke efficiëntie, samen met scherpe verlaging van de kosten, zijn een revolutie in de moderne biologie in onvoorstelbare manieren genoom sequencing projecten snel worden steeds gemeengoed. Bovendien hebben deze ontwikkelingen vooruitgang op vele andere terreinen zoals genexpressie analyse met behulp van RNA-Sequencing (RNA-Seq), studie van genoom-brede epigenetische modificaties, DNA-eiwit interacties verzinkt en screening op microbiële diversiteit in menselijke gastheren. NGS-gebaseerde RNA-Seq name heeft het mogelijk gemaakt om de kaart transcriptomes identificeren en volledig nauwkeurig en gevoelig en heeft microarray technologie vervangen de voorkeursmethode voor expressieprofilering. Terwijl microarray technologie uitgebreid gebruikt, wordt beperkt door de afhankelijkheid van reeds bestaande arrays met bekende genomische informatie en andere nadelen zoals kruishybridisatie en beperkte aantal veranderingen expressie die betrouwbaar kan worden bepaald. RNA-seq, anderzijds, kan worden gebruikt om zowel bekende als onbekende transcripten, terwijl er lage achtergrondruis vanwege de eenduidige DNA mapping natuur. RNA-Seq, samen met de vele genetische instrumenten aangeboden door model organismen zoals gist, vliegen, wormen, vissen en muizen, heeft gediend als de basis voor een groot aantal belangrijke recente biomedische ontdekkingen. Echter, resteren nog aanzienlijke uitdagingen die NGS ontoegankelijk voor de bredere wetenschappelijke gemeenschap, met inbegrip van beperkingen van de opslag, verwerking, en vooral, m eaningful bioinformatica analyse van grote hoeveelheden sequencing data.

De snelle vooruitgang in sequencing technologieën en exponentiële data accumulatie hebt gemaakt een grote behoefte aan computational platforms waarmee onderzoekers om toegang te krijgen, te analyseren en te begrijpen van deze informatie. Vroege systemen waren sterk afhankelijk van computer kennis van programmeren, terwijl genoom browsers zoals NCBI die manier konden niet-programmeurs om toegang te krijgen en te visualiseren data heeft verfijnde analyses niet toe. De web-based, open-access platform, Galaxy ( https://galaxyproject.org/ ), die leemte en bewezen een waardevolle pijpleiding die onderzoekers NGS gegevens te verwerken en het uitvoeren van een spectrum van maakt zijn eenvoudig te complex bioinformatica analyses. Galaxy werd in eerste instantie opgericht, en wordt onderhouden door de laboratoria van Anton Nekrutenko (Penn State University) en James Taylor (Johns Hopkins University)f "> 3. Galaxy biedt een breed scala van rekentaken waardoor het een 'one-stop-shop' voor talloze bioinformatica behoeften, met inbegrip van alle deelnemers aan een RNA-Seq studie stappen. Itallows gebruikers gegevens verwerking uit te voeren, hetzij op haar servers of lokaal op hun eigen machines. de gegevens en workflows kunnen worden gereproduceerd en gedeeld. Online tutorials, help-sectie en een wiki-pagina ( https://wiki.galaxyproject.org/Support ) gewijd aan de Galaxy Project consistente ondersteuning. echter, voor de eerste keer gebruikers, met name degenen die geen bio-informatica opleiding, de pijpleiding kan ontmoedigend verschijnen en het proces van zelf-leren en vertrouwd kan tijdrovend zijn. Bovendien is het biologische systeem bestudeerd en bijzonderheden van het experiment en de gebruikte methoden, invloed de analytische beslissingen op verschillende stappen, en deze kunnen moeilijk te navigeren zonder instructie.

De Overall RN A-Seq Galaxy workflow bestaat uit uploaden van gegevens en kwaliteitscontrole gevolgd door analyse met behulp van Smoking Suite ^{4, 5, 6, 7, 8, 9,} die een collectief van diverse werktuigen voor verschillende stadia van RNA-Seq gegevensanalyse ^{10, 11, 12, 13, 14.} Een typische RNA-Seq experiment bestaat uit het experimentele gedeelte (monsterbereiding, mRNA isolatie en cDNA-bibliotheek voorbereiding), NGS en bioinformatica gegevensanalyse. Een overzicht van deze secties, en de stappen die betrokken zijn bij de Galaxy pijpleiding, worden getoond in Figuur 1.

3fig1.jpg"/>
Figuur 1: Overzicht van een RNA-Seq workflow. Afbeelding van de experimentele en computationele stappen van een RNA-Seq experiment om het gen-expressieprofielen van twee worm stammen (A en B, oranje en groen lijnen en pijlen respectievelijk) vergelijken. De verschillende modules van Galaxy gebruikt worden in dozen met de desbetreffende stap in ons protocol rood aangegeven. De uitgangen van verschillende bewerkingen zijn geschreven in grijs met de bestandsformaten in blauw. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

De eerste tool in de Tuxedo Suite is een alignment programma genaamd 'Tophat'. Het breekt NGS ingang leest in kleinere fragmenten en mapping van een referentie genoom. Dit tweestapsproces zorgt leest overspannende introngebieden waarvan de uitlijning anders disrupted of gemiste worden verantwoord en in kaart gebracht. Dit verhoogt dekking en vergemakkelijkt de identificatie van nieuwe splice junctions. Tophat uitvoer wordt geregistreerd als twee bestanden, een bestand BED (informatie over splitsingsplaatsen die genomische locatie bevatten) en BAM bestand (met mapping gegevens van elke lees). Vervolgens wordt het bestand BAM gericht tegen een genoom verwijzing naar de veelheid afzonderlijke transcripten schatten binnen elk monster in de eerstvolgende gereedschap in de Smoking Suite genaamd 'Manchetknopen'. Manchetknopen functies door het scannen van de uitlijning volledige lengte transcriptfragmenten of 'transfrags' dat alle mogelijke splice varianten van de invoergegevens voor elk gen overspannen melden. Op basis hiervan, genereert een 'transcriptoom' (assemblage van alle transcripten gegenereerd per gen voor elk gen) voor elk monster dat wordt gesequenced. Deze manchetknopen samenstellen worden vervolgens ingestort of samengevoegd, samen met de referentie genoom één annotatiebestand voor downstream differentiële analyse met behulp van de volgende gereedschap 'Cuffmerge' te produceren. Tenslotte de 'Cuffdiff' hulpmiddel maatregelen differentiële genexpressie tussen de monsters door vergelijking van de TopHat uitgangssignalen van elk van de monsters aan de uiteindelijke Cuffmerge uitvoerbestand (figuur 1). Manchetknopen gebruikt FPKM / RPKM (Fragments / Leest Per kilobase van transcript per miljoen toegewezen leest) waarden transcript abundanties melden. Deze waarden weerspiegelen de normalisering van de ruwe NGS gegevens diepte (gemiddeld aantal gelezen uit een monster die zijn afgestemd op de referentie-genoom) en gen lengte (genen verschillende lengten, zodat tellingen moeten worden genormaliseerd voor lengte van een gen niveaus vergelijken tussen genen). FPKM en RPKM in wezen hetzelfde met RPKM gebruikt voor één-end RNA-Seq waar elke lees- overeenkomt met een enkel fragment, dat wordt gebruikt voor FPKMgepaarde-end RNA-Seq, zoals verklaart het feit dat twee leest kan overeenkomen met hetzelfde fragment. Uiteindelijk is het resultaat van deze analyse is een lijst van genen die differentieel tot expressie van de voorwaarden en / of stammen getest.

Zodra een succesvolle Galaxy run is voltooid en een 'gene list' wordt opgewekt, de volgende logische stap vereist meer bioinformatica analyses om betekenisvolle kennis af te leiden uit de datasets. Veel softwarepakketten zijn ontstaan om tegemoet te komen aan deze behoefte, met inbegrip van openbaar beschikbare web-based computational pakketten zoals DAVID (de Database voor annotatie, visualisatie en geïntegreerde discovery) ^15. DAVID vergemakkelijkt toekennen biologische betekenis van grote gen lijsten van high-throughput onderzoek door het vergelijken van het gen lijst geüpload naar de geïntegreerde biologische kennisbank en waaruit de biologische aantekeningen in verband met de lijst gen. Daarna volgt Enrichment Analysis, dwz tests identify eventueel biologisch proces of gen klasse oververtegenwoordigd in de lijst (en) gen op een statistisch significante wijze. Het is uitgegroeid tot een populaire keuze als gevolg van een combinatie van een brede, geïntegreerde kennis-base en krachtige analytische algoritmen die onderzoekers in staat stellen om de biologische thema verrijkt binnen detecteren genomics-afgeleid 'gene lijsten' ^{10, 16.} Bijkomende voordelen zijn onder meer de mogelijkheid om gen lijsten gemaakt op de elke sequencing platform en een zeer gebruiksvriendelijke interface te verwerken.

De nematode Caenorhabditis elegans is een genetisch modelsysteem, bekend om zijn vele voordelen zoals kleine grootte, absorberende stof eenvoudig lichaamsplan, gemak van cultuur en grote ontvankelijkheid voor genetische en moleculaire dissectie. Wormen een kleine, eenvoudige en goed geannoteerde genoom die tot bevat tot 40% geconserveerde genen met bekende humane homologen ^17. Inderdaad, C. eleganswas de eerste metazoan waarvan het genoom werd volledig gesequenced ¹⁸ en een van de eerste soort waarbij RNA-Seq werd gebruikt om een organisme transcriptoom ^{19, 20} in kaart. Vroege worm studies werden uitgevoerd bij het experimenteren met verschillende methoden voor high-throughput RNA capture, bibliotheek voorbereiding en sequencing, evenals bioinformatica pijpleidingen die hebben bijgedragen aan de vooruitgang van de technologie ^{21, 22.} In de afgelopen jaren is RNA-Seq-gebaseerde experimenten in wormen gemeengoed geworden. Maar, voor de traditionele worm biologen de uitdagingen van geautomatiseerde analyse van RNA-Seq data blijft een grote belemmering voor een grotere en betere benutting van de techniek.

In dit artikel beschrijven we een protocol voor het gebruik van Galaxy platform high-throughput RNA-Seq data gegenereerd uit C. elegans analyseren. Voor veel first-time en kleine scale gebruikers, de meest kosten-efficiënte en eenvoudige manier om een ​​RNA-Seq experiment ondernemen is om RNA te isoleren in het lab en gebruik maken van een commerciële (of in-house) NGS faciliteit voor de bereiding van sequencing cDNA bibliotheken en het NGS zelf. Vandaar dat we eerst de stappen van isolatie gedetailleerde, kwantificering en kwaliteitsbeoordeling van C. elegans RNA monsters voor RNA-Seq. Vervolgens geven we stap voor stap instructies voor gebruik van de Galaxy interface voor analyses van de NGS gegevens, te beginnen met testen voor post-sequencing kwaliteitscontroles gevolgd door uitlijning, assemblage en differentiële kwantificering van genexpressie. Daarnaast hebben we opgenomen een routebeschrijving naar het gen lijsten die voortvloeien uit Galaxy voor biologische verrijking studies met behulp van DAVID onderzoeken. Als laatste stap in de workflow, bieden we instructies voor het uploaden RNA-Seq gegevens over de openbare servers, zoals de Sequence Lees Archive (SRA) op NCBI ( http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) om deze vrij toegankelijk zijn voor de wetenschappelijke gemeenschap. Over het algemeen verwachten we dat dit artikel uitgebreide en voldoende informatie zal verstrekken aan worm biologen onderneming RNA-Seq-experimenten voor het eerst als frequente gebruikers die een klein aantal monsters.