在这里, 我们描述了一种色谱检测, 再加上多肽前体离子迁移分离的高分辨率 (~ 3万) MS-肽片段的检测, 用于定量测定单克隆抗体中的尖肽标准消化。
对蛋白质 biotherapeutics 中的低级 (1-100 ppm) 蛋白质杂质 (例如,宿主细胞蛋白 (HCPs)) 的分析是一项挑战性的试验, 需要高灵敏度和广泛的动态范围。基于质谱的蛋白质定量测定通常涉及蛋白质消化, 其次是选择性反应监测/多反应监测 (SRM/MRM) 使用低分辨率 (Rs ~ 1000) 串联的肽量化四极质谱仪。这种方法的一个局限性是, 当感兴趣的肽具有 “相同的” 前体和片段质量 (以 m-/z 值表示) 时, 就会出现干扰现象, 如样品中的其他共洗脱肽 (在 1-Da 窗口内)。为了避免这种现象, 我们提出了一种替代质谱方法, 一种高选择性 (HS) MRM 检测, 将肽前体离子迁移分离与高分辨率 (Rs ~ 3万) MS 检测肽片段结合起来。我们探讨了这种方法的能力, 以量化低丰度肽标准在单克隆抗体 (抗体) 文摘, 并证明它具有灵敏度和动态范围 (至少3级数量) 通常达到在分析。所有六肽标准检测的浓度低至 0.1 nM (1 femtomole 载于2.1 毫米的 ID 色谱柱) 存在高丰度肽背景 (2 µg 的单克隆人的摘要载列)。在考虑了家兔磷酸化酶 (97.2 kDa) 的兆瓦, 从其中提取了尖刺肽, loq 矿用的含量低于 50 ppm。在本研究中, 在整个浓度范围 (0.1-100 nM 或 1-1, 000 ppm) 中, 峰值区 (n = 4 复制) 的相对标准偏差小于15%。
在工业环境中对大型生物分子 (蛋白质) 的量化目前基于免疫 (例如, ELISAs), 主要是由于以下几个优点: 灵敏度、高通量、易用性以及每个样本的低成本。当应用于分析蛋白质治疗中存在的低丰度蛋白质杂质 (1-100 ppm 的宿主细胞蛋白 (HCPs)) 时, 这些生物检测通常提供总的浓度 (通常用 ppm 或 ng/毫克单克隆表达), 但它们无法识别和测量单个的污染物。最近开发了几种基于 MS 的检测方法来补充 ELISAs 或提供 ELISAs 无法提供1、2、3、4、5、6的信息。,7,8,9. 由于样本复杂度和要求检测的范围广泛的动态范围内的浓度 (至少3级), 多维色谱方法招标广泛的样品分馏有传统上用于帮助识别低丰度的 HCPs1,2,3,4,5,6,7。
在生物识别和验证之后, 一个自然的步骤是跨多个批次的跟踪 (监视)。在这种情况下, 建议采用单维 LC/MS 方法来提高示例吞吐量8,9。然而, 在 1D LC/MS 检测中, 由于生物制药肽的压倒性存在, 其准确性和动态范围可能受到影响。与多维分离相比, 信号干扰的可能性19,20,21,22在单维色谱分离中增加, 因为概率为更多的肽前体是共同洗脱的增加。在不延长色谱分离时间的情况下, 采用正交方法分离肽前体显然是有利的。行波离子移动性 (TWIM)10具有解决拥塞的 MS 频谱的能力, 以毫秒为单位。在单肽的洗脱过程中, 大约500的移动分离可以进行, 假设全色谱峰值宽度为十年代, 并考虑到离子移动仪器上的 IM 分离的运行时间为 20 ms。
在过去十年中, 使用公认的 (多) 反应监测方法 (SRM/MRM 方法) 在串联质谱仪上实施的质量分光光度测定法已经成功地开发了11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 ,22,23。这种低分辨率质谱检测的局限性之一是干扰现象19,20,21,22在感兴趣的肽有 “相同” 时观察到。前体和片段质量作为其他共同洗脱肽在样品 (在 1 Da 窗口之内) 存在。提高 SRM/MRM 方法的准确性有两种方法: 一种选择是在前体级别上额外的分离步骤, 以去除干扰前体离子, 而另一种选择是增加前体/片段检测的 MS 分辨率, 以避免重复 MS 信号。此处描述的高选择性 (HS) MRM 捕获模式利用这两种方法, 将肽前体的离子迁移分离与高分辨率 (Rs ~ 3万) MS 检测肽片段相结合。这里描述的检测至少包含三级的数量, 这是在 SRM/MRM 蛋白质组学实验中通常观察到的动态范围17,18,24。
通过监测单克隆抗体文摘中不同浓度 (0.1 至 100 nM 范围) 的六肽标准所产生的信号的线性度, 证明了 HS-MRM 检测方法的实用性。
高分辨率 (Rs > 2万) 质谱法通常用于各种仪器平台上治疗蛋白的结构表征。相比之下, 基于 MS 的蛋白质量化通常是用 SRM/MRM 在低分辨率 (Rs ~ 1000) 串联四极质谱仪上使用由蛋白质酶解裂解产生的特征肽11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. 由于单维色谱分离不能完全解决酶消化产生的复杂肽混合物, 因此, 即使是单蛋白消化, 肽共洗也是常见的现象。对于非常复杂的蛋白质文摘 (例如,在治疗蛋白产生的富含多肽背景的情况下量化 1-100 ppms HCPs), SRM/MRM 测定的灵敏度、准确度或线性度可能受干扰。
SRM/MRM 检测具有维选择性, 只依赖于 “独特” 的前体/片段质量组合。因此, 当肽背景发生意外变化 (例如从不同的纯化过程获得的生物制药样品) 时, 这些化验结果会失败。为了克服这些局限性, 我们提出了一种高选择性 (HS) MRM 检测方法, 该方法在离子移动性高分辨率四极飞行时间 (QTOF) 混合质谱仪 (仪表图 6) 上实现。
该仪器将感兴趣肽的前体与离子迁移细胞中的其他共洗脱 (干扰) 肽前体分离, 将四极中前驱体的完整同位素包层分离, 并将其与固定的 CE 分割在碰撞细胞。通过调整推送频率 (目标增强), 可选择性地将感兴趣的质量区域推送到飞行管中, 而不是所有的离子, 就像完全扫描一样, 由其最丰富的肽片段产生的信号进一步增强。肽量化是使用该片段离子产生的高 MS 分辨率 (Rs ~ 3万) 信号进行的。与 SRM/mrm 测定法相比, HS mrm 检测提供了两种额外的选择性: 一种是由前驱体级离子流动分离提供的, 而第二种则是由飞行时间分析仪的质量分辨率增加而提供的。这些选择性改进所带来的结果在图7中显示的 HS MRM 图谱中可见, 在三级范围内没有干扰。
与 SRM/mrm 检测不同, 有几个参数可以调整以优化 HS-mrm 检测: 在肽前驱体周围的 RT 窗口 (通常设置在0.2 分钟), 四极隔离窗口 (4 Da), 漂移时间窗口围绕前体 (FWHM 的前驱峰从相应的离子 mobilogram), 和 MS 分辨率的片段离子 (2000万)。HS-MRM 检测是非常敏感的: 每种 femtomole 肽含量最低的测定量是1在柱上 (或 0.1 nM 在肽浓度方面)。当考虑肽兆瓦 (参见表1为准确 MWs), 在专栏被发现的数量是以 1-2 pg 的顺序, 而专栏被装载与一个显著地更高的数量 (2 µg) 背景肽从抗体文摘。
通过考虑提取尖肽的全长 kDa 蛋白 (97.2) 的分子量, 该检测能够检测出高丰度背景离子存在下蛋白质杂质的 50 ppm。更低的检测限度 (5-10 ppm) 是可以实现的低分子量 HCPs (10-20 kDa)。该检测涵盖三级 (如图8中的校准曲线所示), 这意味着它可以测量1-1、000 ppm 范围内的 HCPs。此外, 表3所示的 HS MRM 测定的重现性与小分子 SRM/MRM 测定的重现性非常吻合, 峰值面积 RSDs 优于15%。
我们探讨了一种新的检测方法, 以定量的尖刺肽标准的单克隆抗体 (克隆) 文摘, 并表明其灵敏度和效用, 以涵盖广泛的动态范围 (至少三级数量) 通常在分析中遇到。所有六肽标准检测的浓度低至 0.1 nM (1 femtomole 载于2.1 毫米的 ID 色谱柱) 存在高丰度肽背景 (2 µg 的单克隆人的摘要载列)。通过将靶向 HRMS 和离子流动前体分离结合起来, HS MRM 检测具有很大的潜力, 能够成为跨多批次生物的多 HCPs 的快速、高通量监测检测。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢 Malouin 和托尼卡特林从水公司准备的手稿图6。
Vion IMS Qtof mass spectrometer | Waters | 186009214 | |
Acquity H-Class Quaternary solvent manager (QSM) | Waters | 186015041 | |
Acquity H-Class FTN Sample Manager (SM) | Waters | 186015040 | |
Acquity H-Class Column Manager (CM) | Waters | 186015043 | |
Acetonitrile (ACN) | Fisher Chemical | A996-4 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 40867-50G-F | |
2.1 x 150 mm CSH C18 UPLC column, 1.8 µm particles | Waters | 186005298 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
Formic acid, eluent additive for LC/MS | Sigma Aldrich | 56302-10X1ML-F | |
Hi3 rabbit phosphorylase (PHO) MassPREP standard | Waters | 186006011 | |
Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | I-1149-5G | |
LC vials (12×32 mm glass vials, screw neck) | Waters | 186000327c | |
Leucine Enkephalin acetate salt hydrate | Sigma Aldrich | L9133-10MG | |
Protein LoBind 2.0 mL tubes (2×50) | Eppendorf | 22431102 | |
RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
Trypsin/Lys-C enzyme mix, mass spec grade (5 x 20 µg) | Promega | V5073 | |
Water, LC/MS grade | Sigma Aldrich | 39253-1L-R |