Identificatie van Plasmodesmal lokalisatie sequenties in eiwitten In Planta

Plasmodesmata (Pd) fungeren als leidingen voor intercellulaire vervoer van belangrijke regelgevende instanties van de ontwikkeling van planten en voedselproductie, variërend van transcriptiefactoren tot mRNA en kleine molecules van RNA. Bovendien, deze macromoleculaire transportcapaciteit van Pd wordt gebruikt door de meeste plantenvirussen voor hun intercellulaire verspreiding tijdens infectie; Als u wilt verplaatsen door middel van Pd, geëvolueerd plantenvirussen gespecialiseerde eiwitten, genoemd verkeer eiwitten (MPs), die specifiek gericht zijn op Pd^{1,2,3,4,5,6 , 7}. moleculaire pathways van Pd vervoer waarschijnlijk zijn nauw met elkaar verbonden met de specifieke opeenvolgingen die gericht zijn op de vervoerde hoeveelheden eiwitten in deze trajecten. Dus, is identificatie van deze Pd lokalisatie signalen (PLSs) diagnose van het overeenkomstige Pd vervoer traject mogelijk. Dit wil analogie van Pd vervoer⁸, bijvoorbeeld verschillende nucleaire importeren trajecten, die kunnen wel specifiek voor verschillende nucleaire localisatie signaal (NLS) sequenties^9,10. Conceptueel, vertegenwoordigen zowel NLSs als PLSs niet-cleavable subcellular targeting sequenties die noodzakelijk voldoende zijn voor targeting en. Echter, in tegenstelling tot de NLSs¹¹, de opeenvolgingsinformatie over PLSs is zeer beperkt. Specifiek, zijn slechts vier proteïne sequenties die betrokken zijn bij de Pd gericht op gemeld, met allemaal afgeleid van endogene plantaardige eiwitten. De eerste die wordt vertegenwoordigd door een domein van de homeobox van KN1¹² – een transcriptiefactor waarmee wordt verplaatst van de cel van de binnenste lagen naar de opperhuid van de plant blad¹³ – en haar KNOX homologen¹⁴. In het tweede voorbeeld is ook van een transcriptiefactor, Dof, waarin een vermeende PLS beschreven als de intercellulaire handel (IT) motief¹⁵. De derde reeks is uit het PDLP1 plasmodesmata-ingezeten type 1 membraan eiwit, en het wordt vertegenwoordigd door een transmembraan domein¹⁶. Tot slot, de vierde Pd gericht op volgorde werd onlangs gemeld voor glycosylphosphatidylinositol (GPI)-verankerd eiwitten en het wordt vertegenwoordigd door de glycosylphosphatidylinositol (GPI) wijziging signaal¹⁷.

Interessant, tot voor kort geen PLSs gemeld voor virale MPs. Eerdere studies aangegeven de aanwezigheid van vermeende PLS sequenties in plant virale MPs^18,19, maar geen echte PLS, dat wil zeggen, een minimale aminozuur reeks zowel noodzakelijk als voldoende voor Pd targeting van een ongerelateerde lading molecuul ( bijv., GVB) in een virale MP is geconstateerd. Nog was een van deze proteïnen, MP van het tabak mosaic virus (TMV), de eerste die Pd lokalisatie en vervoer al aangetoond dat²⁰.

Om deze leemte, ontwikkelden we een experimentele strategie ter identificatie van TMV MP PLS. Deze strategie was gebaseerd op drie concepten. (i) we PLS gedefinieerd als een minimale aminozuur-reeks die noodzakelijk en voldoende zijn voor het targeten van eiwit Pd²¹. (ii) omdat TMV MP eerst Pd richt en vervolgens translocates via deze kanalen²², we gericht op het afkoppelen van deze twee activiteiten en het identificeren van de bonafide PLS, welke functies alleen voor Pd targeting, en niet voor het latere vervoer. (iii) we geanalyseerd de geïdentificeerde PLS voor aminozuurresidu’s belangrijk voor haar Pd gerichte activiteit, structureel of functioneel. Met behulp van deze aanpak, we een 50-amino acid residu-reeks op de amino-terminus van TMV MP die als bonafide PLS fungeert afgebakend. Dit werd gedaan door de productie van een reeks van TMV MP fragmenten die verzadigd van de gehele lengte van het eiwit, tagging hun carboxyl-termini met GVB en Transient uiten ze in plantaardige weefsels. PD lokalisatie van elk van de geteste fragmenten werd bepaald door coexpressing hen met een Pd marker eiwit, PDCB1 (Pd callose bindende eiwitten 1)²³. Het kleinste fragment dat nog steeds gelokaliseerd op Pd, maar deed niet doorkruisen Pd, werd beschouwd als PLS vertegenwoordigen. Ten slotte was het PLS alanine-gescand om te bepalen van de belangrijkste aminozuurresidu’s nodig zijn voor de structuur en/of functie.

Overwegende dat hier we deze benadering illustreren door de identificatie van TMV MP PLS beschrijven, kan het worden gebruikt om te ontdekken PLSs in elke andere Pd-gerichte eiwitten, of gecodeerd door plant ziekteverwekkers of door de planten zelf; Dit is omdat onze werkwijze niet van eventuele unieke kenmerken van virale MPs met betrekking tot hun vermogen om doel te Pd profiteren doet.