MALDIイメージングマススペクトロメトリーのためのラット脳組織におけるガングリオシドの検出と可視化のためのDANマトリックスの昇華

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化（MALDI）イメージングマススペクトロメトリー（IMS）は、高度にそのまま試料表面全体の脂質の空間分布の可視化のための技術、ペプチドおよびタンパク質引っ張りだこになってきています。 MALDI IMSは、予め予備精製分析物のための分析技術として知られていたが、近年では、理由なしに、高解像度の視覚的/解剖学的基準点と質量分析の精度を結合する能力の他の多くの分野で注目されています任意の外部標識のために必要。この技術を利用する研究の科学的プールが成長し続けるにつれて、IMS実験の開発および最適化を支援するための標準化され、簡単に従うプロトコルの増加が必要です。ガングリオシド、中枢神経系に非常に豊富な膜脂質の群、膜内に埋め込まれたそれらの場所、としてMALDI IMS実験のための理想的であるが、特定の具体を作ります従来の免疫標識を用いて検出することは不可能エス。さらに、我々は、細胞シグナル伝達の調節因子として機能するこれらの脂質は、とりわけ、脳損傷^3、4、5後に変更された健康な齧歯類脳における固有の解剖学的分布パターンを有することを、MALDI IMSを使用して、示されています。ガングリオシドは、ほとんどの脂質種と比較してより高い質量範囲にあり、したがって、MALDIイメージングプラットフォームに最適されています。

図1：MALDI IMS実験のワークフロー。昇華を使用して、MALDI IMS実験の一般的なワークフローの図。 -80℃で凍結した組織は、クライオスタットに区分され、10μmの切片は、解凍は、導電性のITOスライド上にマウントされています。次いで、スライドを昇華するまでデシケーター中に置かれています。 SLIDESは、昇華装置内に挿入され、マトリックスの均一な層は、組織試料の表面に塗布されます。次いで、試料を10分間デシケーター中に入れ、-20℃の冷凍庫で一晩凍結されています。基準が適用された後、サンプルは、レーザーをイオン化するためにマトリックスに脱離した分子を引き起こす組織を横切って向けられているMALDI機器に挿入されます。イオンは、フライトチューブを下に移動し、彼らは検出器に到達するまで、その質量（飛行時間型/ TOF）に基づいて分離します。所定の質量対電荷（m / z）範囲内の検体のイオン豊富な情報を、分子画像とマススペクトルの両方として表示されます。このデータは、撮像された組織内の関心のある検体のイオン存在量を視覚化し、定量化の両方に使用することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

試料調製プロセスの各ステップは、目的の分析物に合わせてカスタマイズされなければならないようMALDI IMSのための非常に可変です。 MALDIベースの実験の決定的な特徴は、分析前に試料表面上に堆積マトリックスコーティングを使用することです。アブレーションプロセスの間にレーザからの放射エネルギーを吸収し、転写の役割に加えて、マトリックスは、それによって関心^6,7の化合物の分析を容易にする、試料からの種々の分析物を分離するのに役立ちます。試料表面にマトリックスの均質な適用は、サンプル調製プロセスにおける最も重要な工程です。不適切なマトリックス沈着は、大規模な異種のマトリックス結晶形成や工芸品の開発、低イオン信号、および再現性が悪い⁷につながることができます。

原因特定の検体を分離するために、特定の行列の親和性に、マトリックスの種類は、実験のために選択することができます大幅に結果を変えます。タンパク質およびペプチドの画像化に使用されるマトリックスは、多くの場合、画像化脂質のために使用されるものとは異なる処理が正常組織からの信号を検出するために、そのような洗浄及び再水和の工程などの追加の手順を必要とすることにより、さらに複雑です。洗浄工程は、脂質シグナル⁸の増強のために存在するが、それらはほとんどの脂質種の検出のための前提条件ではありません。脂質イメージング実験のためのマトリックスを選択するとき、適切な基質の範囲が狭くなります。このような目的の脂質の極性を考慮することが重要です。例えば、ガングリオシドは、それらを全体的に負極性を与えるシアル酸残基が含まれています。効果的に脱着および組織からのガングリオシドをイオン化することができます行列の数があります。しかし、このような真空下での行列のスペクトルと安定性のマトリックス由来のピークのような要因が考慮の下で撮影する必要があります。 1,5- diaminonapthalene（DAN）マトリックスは、画像処理アプリケーションの大部分のための機器真空条件下で十分に安定であり、脂質の脱離のための高感度を示した正および負のイオンモード²の両方における脂質の分析のために使用することができます。このようなジヒドロキシ安息香酸（DHB）、9-アミノアクリジン（9-AA）、及び5-クロロ-2-メルカプトベンゾチアゾール（CMBT）のような他の負の脂質親和性マトリックスと比較した場合、DANマトリックスは、最も効率的にラット脳のガングリオシドを脱着することができました負イオンモード（原稿準備中）で組織。

マトリックス沈着の適切な方法を選択すると、マトリックス自体を選択することに等しく重要です。液体は、追加を可能にするために、試料を透過などの固体マトリックスは、有機溶媒に溶解し、空気圧によって堆積またはスプレーまたはスポッターを自動化された湿ったマトリックス沈着法は、タンパク質およびペプチドの脱離のために特に有効ですマトリックスを有する化合物と共結晶化のction。これらの技術は、脂質アプリケーション、検体の非局在化と不均一なマトリックス結晶形成のためにも使用することができるが、特に組織^2,9において、溶媒中の脂質の高い存在量及び溶解度に起因する一般的な出来事です。脂質は容易に組織からイオン化されているため、例えば、昇華などの乾燥マトリックス堆積技術は、単純に提供これらの技法の欠点の多くを回避しながら、噴霧器への効果的な代替手段を要します。 MALDI IMS実験における昇華の成功は、このようなマトリックス-検体結合増加マトリックス純度、湿式マトリクス技術^1、10と比較して増加した再現性をもたらす均一なマトリックス沈着のための表面積を増大させる微結晶マトリックスの形態などの機能に起因します。

昇華invo直ちに組織試料表面上に堆積する粉末マトリックスの気相転移を固体で得冷却試料表面下の真空下で粉末化マトリックスを加熱LVES。昇華中、マトリックス沈着は、時間、温度、および再現性の高い結果を提供するための圧力として変化要因によって制御することができます。単一昇華実験を廃棄する前に数回再使用することができる選択されたマトリックスのタイプに応じて5〜20分にかかります。この装置は、自動化された噴霧器の価格のほんの一部で商業的に購入することができ、容易にクリーニングやメンテナンスのために解体されます。低コストで、この行列の堆積技術の相対的なシンプルさが始まるまたはMALDI IMSにおける脂質イメージング用途に拡張する研究者に最適です。 IMSのための組織の昇華のためのプロトコルの詳細情報^11が報告されているが、いくつかの標準化されたプロトコルは、Wが存在しますHICH、それが困難な大規模な試行錯誤することなく、技術を確立すること、負イオンモードで高質量の脂質を撮像するための昇華実験を行うことに伴う基本的なワークフローに焦点を当てます。以下は、ガングリオシドの高分解能イメージングおよび検出のために、ラットの脳切片上にDAN行列の昇華のためにそのギャップを埋めることを目指した実験のプロトコルです。

図2：昇華装置。写真（A）及び昇華装置の概略図（B）。真空ポンプは、エタノール300mlを充填した冷却トラップにゴム管により接続されています。コールドトラップは、その後、昇華装置にゴム管により接続されています。装置は、金属Uジョイントと共に密封されているガラス製品の二つの別個の片から構成されています。昇華の上半分氷のスラッシュが充填されているコンデンサーが含まれています。サンプルプレートは、密閉ガラス装置内のコンデンサーの底部上にテープ止めされています。昇華装置の下半分は、均等にサンプルプレートに面して広がる、DAN行列が含まれています。昇華中、ガラス装置は、直接下にホットプレートにより140℃に加熱した砂浴上に配置されます。温度プローブは、実験用の設定温度に比べて砂浴温度のフィードバックを通じて昇華実験を通して安定した温度を維持するのに役立ちます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。