Co-immunoprecipitation tarafından Nükleer ve Sitoplazmik Kesirler Protein-protein Etkileşim görselleştirme ve<em> In Situ</em> Proximity ligasyon Testi
Summary
Protein-protein interactions can occur in both the nucleus and the cytoplasm of a cell. To investigate these interactions, traditional co-immunoprecipitation and modern proximity ligation assay are applied. In this study, we compare these two methods to visualize the distribution of NF90-RBM3 interactions in the nucleus and the cytoplasm.
Abstract
Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation is a popular technique to detect protein-protein interactions. Subsequent Western blot analysis is the most common method to visualize co-immunoprecipitated proteins. Recently, the proximity ligation assay has become a powerful tool to visualize protein-protein interactions in situ and provides the possibility to quantify protein-protein interactions by this method. Similar to conventional immunocytochemistry, the proximity ligation assay technique is also based on the accessibility of primary antibodies to the antigens, but in contrast, proximity ligation assay detects protein-protein interactions with a unique technique involving rolling-circle PCR, while conventional immunocytochemistry only shows co-localization of proteins.
Nuclear factor 90 (NF90) and RNA-binding motif protein 3 (RBM3) have been previously demonstrated as interacting partners. They are predominantly localized in the nucleus, but also migrate into the cytoplasm and regulate signaling pathways in the cytoplasmic compartment. Here, we compared NF90-RBM3 interaction in both the nucleus and the cytoplasm by co-immunoprecipitation and proximity ligation assay. In addition, we discussed the advantages and limitations of these two techniques in visualizing protein-protein interactions in respect to spatial distribution and the properties of protein-protein interactions.
Introduction
Nükleer faktör 90 (NF90) interlökin-2 sonrası transkripsiyonu ve miRNA biogenez 1-3 düzenlenmesi viral enfeksiyona yanıt, yönetmelik dahil olmak üzere sayısız fonksiyonları ile çok izoformu proteindir. RBM3 bir RNA bağlayıcı protein, çeviri ve miRNA biyogenezine katılan ve hipotermi ve hipoksi 4-6 dahil olmak üzere çeşitli stres tarafından uyarılan edilebilir. Son zamanlarda, bir protein kompleksi 7 NF90 ve RBM3 bulundu. NF90 ve RBM3 etkileşimi katlanmamış bir protein tepki 7 protein kinaz RNA gibi endoplazmik retikulum kinaz (PERK) aktivitesini modüle etmek için gereklidir. NF90 ve RBM3 Hem çekirdekte ama sitoplazma içine küçük bir NF90 oranı ve RBM3 mekik ağırlıklı olarak bulunduğu ve PERK aktiviteyi düzenleyen, özel fonksiyonlar için birbirlerine orada örneğin bağlama vardır. Nedenle, yeni gösterebilir, hücre içi bölmeye NF90-RBM3 etkileşimleri dağılımını görselleştirmek için önemlidirİlgili bölmeye onların çeşitli rolleri.
Yıllar önce, maya iki hibrid (Y2H) iki protein 8 arasındaki etkileşimi saptamak için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, erimiş proteinleri yapay bir yapı için, yanlış pozitif sonuçlar, bu yöntemin uygulanmasını sınırlamıştır. Uzun bir süre, ko-immünopresipitasyon özellikle endojen koşullarda 9, protein-protein etkileşimleri analiz etmek ana tekniktir. Süper hassasiyet ve kesinlik arzu edildiğinde kütle spektrometresi kullanılır ise birlikte imüno-çökeltilmiştir protein kompleksi analiz etmek için, Batı benek, en uygun bir tekniktir. Son yıllarda, proksimite ligasyonu deney yerinde 10,11 hem hücre ve dokularda protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için yeni bir yöntem olarak geliştirilmiştir.
Burada, NF9 yakalayan en popüler ko-immünopresipitasyon yöntemi ve nispeten yeni yakınlık ligasyonu tahlil yöntemi karşılaştırıldısub-hücresel fraksiyonlarında, 0 RBM3 etkileşimi. Biz de avantajları ve her iki tekniğin sınırlamaları tartışılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her iki yöntem için çeşitli faydalar yanı sıra eksiklikler vardır. nispeten yeni bir teknik olarak, yakınlık ligasyon tahlili açık bir avantajı, tek hücre düzeyinde yerine heterojen bir hücre yığın protein-protein etkileşimlerini aydınlatmak için fizibilite olup. Yüksek büyüklükte ve (konfokal mikroskop ile) çözünürlükte Görüntüler tek floresan noktalar sayarak ölçümü için olanak sağlamaktadır. Buna karşılık, Western Blot ile ko-immünopresipitasyon tekniğinin gelenek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Swiss National Science Foundation (SNSF, 31003A_163305).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D6429 | High glucose 4500 mg/L |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin (PenStrep) | BioConcept | 4-01F00-H | |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein G | Novex, Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76 (NF90/NF110) antibody | BD Transduction Laboratories | 612154 | use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| RBM3 antibody | ProteinTech | 14363-1-AP | use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| Lamin A/C antibody | Cell Signaling Technology | #2032 | use 1:1000 for WB |
| anti-GAPDH antibody | Abcam | ab8245 | use 1:1000 for WB |
| normal rabbit IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| anti-rabbit IgG, HRP-lined secodary antiboy | Cell Signaling Technology | #7074 | use 1:5000 for WB |
| anti-mouse HRP secondary antibody | Carl Roth | 4759.1 | use 1:5000 for WB |
| Clarity Western ECL Blotting Substrate | Bio-Rad | #1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | CarlRoth | 6908.1 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane | GE Healthcare Life Sciences | 10600021 | |
| Super RX X-ray film | Fujifilm | 4741029230 | |
| Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide | Corning BioCoat | 354632 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Normal goat serum (NGS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink PLA probe Anti-rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink Detection Reagents Red | Sigma | DUO92008 | |
| Duolink Wash Buffers Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Duolink Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| Microscope | Olympus | AX-70 | |
| CCD camera | SPOT | Insight 2MP Firewire | |
| X-ray film | Fujifilm | Super RX | |
| Film processing machine | Fujifilm | FPM-100A |
References
- Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication?. Biochimie. 108, 20-24 (2015).
- Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization. Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).
- Sakamoto, S., et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway. Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).
- Dresios, J., et al. Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis. Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).
- Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis. Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).
- Wellmann, S., et al. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism. J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).
- Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress. FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J Vis Exp. (98), (2015).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).
- Jarvius, M., et al. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).
- Liu, C. H., et al. Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).
