Summary

Um sensor baseado em Aptamer para não quelatada gadolínio (III)

Published: January 09, 2017
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Summary

The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor.

Abstract

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples of gadolinium-based contrast agents as a result of incomplete reactions between the ligand and the ion, or as a dissociation product. Since the ion is toxic, its detection is of critical importance. Herein, the design and usage of an aptamer-based sensor (Gd-sensor) for Gd3+ are described. The sensor produces a fluorescence change in response to increasing concentrations of the ion, and has a limit of detection in the nanomolar range (~100 nM with a signal-to-noise ratio of 3). The assay may be run in an aqueous buffer at ambient pH (~7 – 7.4) in a 384-well microplate. The sensor is relatively unreactive toward other physiologically relevant metal ions such as sodium, potassium, and calcium ions, although it is not specific for Gd3+ over other trivalent lanthanides such as europium(III) and terbium(III). Nevertheless, the lanthanides are not commonly found in contrast agents or the biological systems, and the sensor may therefore be used to selectively determine unchelated Gd3+ in aqueous conditions.

Introduction

A importância crescente das imagens de ressonância magnética (MRI) em diagnóstico clínico, que é limitada pela sensibilidade inerente da técnica, resultou no rápido crescimento de investigação para o desenvolvimento de novos agentes de contraste à base de gadolínio (GBCAs 1). GBCAs são moléculas que são administrados para melhorar a qualidade da imagem, e eles tipicamente têm a estrutura química de um ião trivalente gadolínio (Gd 3+) coordenado a um ligando polidentado. Esta complexação é de importância crítica como D'us não quelatada 3+ é tóxico; tem sido implicado no desenvolvimento de fibrose sistémica nefrogénica, em alguns pacientes com doença renal ou falha 2. Consequentemente, a detecção do íon livre aquosa é fundamental para garantir a segurança dos GBCAs. A presença de não quelatada Gd3 + em soluções GBCA é muitas vezes o resultado de uma reacção incompleta entre o ligando e o ião, a dissociação do complexo, ou displacement por outros cátions metálicos biológicos 3.

Entre as várias técnicas usadas atualmente para determinar a presença de D'us 3+, aqueles que dependem de cromatografia e / ou classificação espectrometria mais alto em termos de versatilidade e aplicabilidade 4. Entre as suas vantagens são de alta sensibilidade e precisão, a capacidade de analisar diferentes matrizes de amostras de soro humano (incluindo 5, urina e cabelo 6, 7 de águas residuais, e formulações de agentes de contraste 8), e a quantificação simultânea de múltiplos complexos Gd 3+ (um perfil de estudos antes de 2013 é descrito em uma revisão abrangente por Telgmann et al.) 4. O único inconveniente é que vários destes métodos requerem instrumentação (tais como espectrometria de massa de plasma indutivamente acoplado) 4 que alguns laboratórios não podem ter acesso. Dentro do contexto da nova descoberta GBCA na investigação e níveis prova-de-conceito, ARmétodo baseado em espectroscopia elatively mais conveniente, rápido e de baixo custo (por exemplo, absorção de UV-Vis ou de fluorescência) pode servir como uma alternativa valiosa. Com esses aplicativos em mente, um sensor baseado em aptâmero fluorescente para aquosa Gd3 + foi desenvolvido 9.

O aptâmero (Gd-aptâmero) é uma molécula de ADN de 44 bases de comprimento de cadeia simples com uma sequência específica de bases que foi isolado por meio do processo de evolução sistemática de ligandos por enriquecimento exponencial (SELEX) 9. Para adaptar o aptâmero em um sensor fluorescente, um fluoróforo está ligado ao terminal 5 'da cadeia, que é então hibridado com uma cadeia de têmpera (QS), através de 13 bases complementares (Figura 1). O QS é marcado com uma molécula quencher escuro no terminal 3 '. Na ausência de Gd3 +, o sensor (Gd-sensor), composta de uma mistura 1: 2 proporção molar de Gd-aptâmero e QS respectivamente, terá de emissão de fluorescência mínima devido tO transferência de energia do fluoroforo para o inibidor. A adição de solução aquosa Gd3 + irá deslocar o QS do Gd-aptâmero, resultando num aumento da emissão de fluorescência.

figura 1
Figura 1. O sensor (Gd-sensor) que consiste no longo aptâmero 44-base (Gd-aptâmero) marcados com fluoresceína (um fluoróforo) e a cadeia de 13 bases de comprimento têmpera (QS) etiquetada com DABCYL (um inibidor escuro) . Na ausência de não quelatada Gd3 +, a fluorescência do sensor é mínima. Com adição de Gd3 +, o deslocamento do QS ocorre e um aumento na emissão de fluorescência é observado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Não existe, actualmente, um método baseado em espectroscopia vulgarmente utilizado para detectaring aquosa 3+ D'us. Este ensaio utiliza o alaranjado de xilenol molécula, que sofre uma mudança no comprimento de onda máximo de absorção 433-573 nm após a quelação com o ião 10. A razão entre estes dois valores máximos de absorvância pode ser usado para quantificar a quantidade de não quelatada Gd3 +. O sensor de aptâmero é uma alternativa (também pode ser complementar) para o ensaio de laranja de xilenol, como os dois métodos têm diferentes condições de reacção (tais como o pH e a composição das soluções tampão utilizadas), selectividades alvo, gamas lineares de quantificação, e as modalidades de detecção 9.

Protocol

NOTA: água de qualidade para biologia molecular é utilizado em todas as preparações de amortecimento e de solução. Todos os tubos descartáveis ​​(microcentrífuga e PCR) e pontas de pipeta são DNase e RNase. Por favor consultar a folha de dados de segurança (FDS) para todos os produtos químicos antes da utilização. Uso de equipamento de proteção individual (EPI) é fortemente recomendado. 1. Preparação de Soluções de Stock aptâmero Comprar 2 fios de polideso…

Representative Results

Uma mudança de fluorescência típica da solução de Gd-sensor na presença de não quelatada Gd3 + é mostrada na Figura 2. A emissão pode ser representada graficamente como a mudança de fluorescência vezes (Figura 2A) ou a fluorescência em bruto leitura (Figura 2B) em unidades arbitrárias (AFU). Ambos os lotes se obter curvas de calibração muito semelhantes, com um intervalo linear de concentrações de Gd 3+</…

Discussion

Usando o Gd-sensor baseado em aptâmero, um aumento na emissão de fluorescência que é proporcional à concentração de não quelatada Gd3 + é observada. Para minimizar a quantidade de amostra utilizada, o ensaio pode ser executado numa microplaca de 384 cavidades com um volume total de amostra de 45 uL por poço. Neste design, a escolha de fluoresceína (FAM) e dabcil (DAB) baseou-se principalmente sobre o custo dos reagentes; para modificar o comprimento de onda de emissão, um emparelhamento diferente …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to gratefully acknowledge Dr. Milan N Stojanovic from Columbia University, New York, NY for valuable scientific input. This work is supported by funding from the California State University East Bay (CSUEB) and the CSUEB Faculty Support Grant-Individual Researcher. O.E., T.C., and A.L. were supported by the CSUEB Center for Student Research (CSR) Fellowship.

Materials

Gd-aptamer IDTDNA Input sequence and fluorophore modification in the order form A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
Quenching strand IDTDNA Input sequence and quencher modification in the order form A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company. 
Molecular biology grade water No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well
Gadolinium(III) chloride anhydrous Strem 936416 Toxic
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Magnesium chloride anhydrous MP Biomedicals 0520984480 – 100 g
Sodium Chloride Acros Organics 327300025
Potassium chloride Fisher Scientific P333-500
Sodium hydroxide, pellets Fisher Scientific BP359 Corrosive
Hydrochloric acid Fisher Scientific SA49 Toxic and corrosive
384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates Corning 3575 Plates which are suitable for fluorescence reading are required. 
Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter Thermo Scientific  5680020 The bottle top is fitted with  0.2 micron PES membrane
Disposable sterile bottles 250 mL Corning 430281 A larger or smaller bottle may be used
1.5 mL microcentrifuge tubes No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
0.2 mL PCR tubes No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Micropipets No specific manufacturer
Pipet tips (non filter) of appropriate sizes No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Name of Equipment
Plate reader Biotek Synergy H1 Plate readers from other manufacturers would work equally well

References

  1. Shen, C., New, E. J. Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 158-166 (2013).
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Cite This Article
Edogun, O., Chan, T. Y., Nguyen, N. H., Luu, A., Halim, M. An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III). J. Vis. Exp. (119), e55216, doi:10.3791/55216 (2017).

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