Voorbereiding en evaluatie van<sup> 99m</sup> Tc-gelabelde tridentaat Chelates voor Pre-targeting Met behulp Bioorthogonal Chemistry
Summary
Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.
Abstract
Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.
Introduction
99mTc radioisotoop nog steeds het meest gebruikt in de diagnostische nucleaire geneeskunde, met meer dan 50 miljoen beeldvormende procedures uitgevoerd per jaar wereldwijd 1, 2, 3. De meeste 99mTc middelen klinisch gebruikte soort perfusie radiofarmaca. Er zijn een beperkt aantal actief gerichte verbindingen waarin 99mTc is gericht op een specifieke biomerker ligatie tot binden aan een targeting construct. Ontwerp van gerichte 99mTc radiofarmaca wordt vaak belemmerd door de invloed van 99m Tc-ligand-complexen op het vermogen van de richtende molecule om de biomarker plaats binden, of isotopen halfwaardetijd te kort is voor gebruik met een hoger gewicht biomoleculen moleculair zoals antilichamen. Dit laatste vereist meestal enkele dagen voor afbeeldingen in volgorde worden verworven voor de biomolecuul te verwijderen uit non-target tiss UES. Pre-targeting biedt een alternatieve benadering van deze uitdagingen te overwinnen.
Pre-targeting gecombineerd met bioorthogonal chemie is aangetoond dat het een effectieve manier om nieuwe moleculaire beeldvorming probes voor zowel fluorescentie en radio-imaging 4, 5, 6, 7, 8 ontwikkelen. De inverse vraag elektron Diels-els (IEDDA) reactie tussen 1,2,4,5-tetrazine (Tz) en trans -cyclooctene (TCO) derivaten, zoals weergegeven in figuur 1, is bijzonder effectief gebleken 6 te zijn. De IEDDA reactie met deze componenten kunnen snel kinetiek vertonen in PBS (k 2 ≈ 6000 M -1 s -1) en hoge selectiviteit, waardoor het ideaal is voor in vivo pre-targeting toepassingen 9, 10.
e_content "> De meest voorkomende aanpak omvat het toedienen van een TCO-afgeleide targeting vector en na een voldoende vertraging periode, is een radioactief tetrazine toegediend. Radioactief gemerkt tetrazine gebaseerd op 11 C, 18 F, 64 Cu, 89 Zr en 111 In zijn geweest meldde 11, 12, 13, 14, 15. daarentegen is er slechts een rapport van een 99mTc-gelabelde Tz, dat werd bereid onder toepassing van een HYNIC soort ligand die het gebruik van co-liganden voor eiwitbinding en afbraak in vivo voorkomen 16. Als alternatief beschrijven we hier de synthese van 99m Tc (I) gemerkt met een tetrazine familie van liganden die stabiele tridentate complexen vormen met een [99mTc (CO) 3] + kern. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pleeftijd = "1">
Figuur 1: De bioorthogonal IEDDA reactie tussen tetrazine en trans -cyclooctene. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De familie van liganden bevatten bereid drietandige chelaten die variëren in polariteit en de aard van de verbindingsgroep tussen het metaal en het bindingsgebied Tz (figuur 2). Het doel was om een 99mTc-tetrazine construeren die effectief kunnen lokaliseren en reageren met TCO-gelabelde plaatsen in vivo en snel duidelijk wanneer niet gebonden identificeren om hoge target-to-non-target-verhoudingen verkregen. De liganden te testen, een TCO-derivaat van een bisfosfonaat (TCO-BP) gebruikt 17. We hebben eerder aangetoond dat TCO-BP lokaliseert gebieden actieve botmetabolisme en kan reageren metradiolabeled tetrazine in vivo 18. Het is handig om nieuwe reagens tetrazine testen, omdat het kan worden bereid in een enkele stap en experimenten kunnen worden uitgevoerd bij normale muizen waarbij lokalisatie vindt voornamelijk plaats in de gewrichten (knieën en schouders).
Protocol
Representative Results
Discussion
Een verzameling van gekoppelde tetrazine tridentaat chelaten van verschillende polariteiten bereid en het nut van de 99mTc complexen in de IEDDA reactie met een TCO derivaat in vivo onderzocht. Een effectief en reproduceerbaar Tc 99m labeling methode ontwikkeld vijf tetrazine-chelaten, waarbij het ligand concentratie 10 -3 M. Het labeling stap werd gevolgd door ontscherming van t-butylgroepen (voor verbindingen 2-5). De hoge concentratie ligand werd geb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work supported by research grant funding from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada, the Ontario Institute for Cancer Research (OICR, #P.SI.015.8), and the Canadian Cancer Society (CCS, #703857). The authors acknowledge the contributions of Dr. Denis Snider who provided assistance in preparing the manuscript.
Materials
| Argon gas | Alphagaz | — | — |
| Na2CO3 | EMD Millipore | 106395 | — |
| Na2B4O7.10H2O | Anachemia | S9640 | — |
| KNaC4H4O6.4H2O | Anachemia | 217255 | — |
| Technelite 99mTc generator | Lantheus medical imaging | — | Source of 99mTcO4- |
| 0.9% Saline | Lantheus medical imaging | — | To elute generator |
| 1 M HCl | Lab Chem | — | — |
| MeOH | Caledon | — | — |
| ACN | Caledon | — | HPLC grade |
| Millipore H2O | Thermo Fisher Scientific | Barnstead Nanopure | — |
| DCM | Caledon | — | — |
| TFA | Caledon | — | — |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 1X |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | — |
| Tween80 | Sigma Aldrich | P8047 | — |
| Isoflurane | CDMV | 108737 | Supplier: Fresenius Kabi Animal Health |
| HPLC | Waters | 1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590) | — |
| HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4 | Phenomenex | 00G-4435-E0 | Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm, |
| HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5 | Waters | 186003115 | XBridge BEH C18 Column, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm X 100 mm |
| Microwave Reactor | Biotage | Initiator 8 | — |
| Biotage V10 Evaporator | Biotage | Serial # V1041 | — |
| Dose calibrator | Capintec, Inc. | CRC-25R | — |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | — |
| Animal room scale | Mettler Toledo | XP105 Delta Range | — |
| Microwave vials | Biotage | 355629 | 0.5-2 mL |
References
- Jurisson, S. S., Lydon, J. D. Potential Technetium Small Molecule Radiopharmaceuticals. Chem. Rev. 99 (9), 2205-2218 (1999).
- Kluba, C. A., Mindt, T. L. Click-to-chelate: Development of Technetium and Rhenium-Tricarbonyl Labeled Radiopharmaceuticals. Molecules. 18, 3206-3226 (2013).
- Amato, I. Nuclear Medicines Conundrum. Chem. Eng. News. 87 (36), 58-70 (2009).
- Hnatowich, D. J., Virzi, F., Rusckowski, M. Investigations of Avidin and Biotin for Imaging Applications. J. Nucl. Med. 28 (8), 1294-1302 (1987).
- Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactivity. J. Am. Chem. Soc. 130 (41), 13518-13519 (2008).
- Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Tetrazine-Based Cycloadditions: Application to Pretargeted Live Cell Imaging. Bioconjugate Chem. 19 (12), 2297-2299 (2008).
- Rossin, R., et al. In Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice. Angew. Chem., Int. Ed. 49 (19), 3375-3378 (2010).
- Zeglis, B. M., et al. Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics. Mol. Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).
- Rossin, R., et al. Highly Reactive trans-Cyclooctene Tags with Improved Stability for Diels-Alder Chemistry in Living Systems. Bioconjugate Chem. 24 (7), 1210-1217 (2013).
- Rossin, R., Robillard, M. S. Pretargeted Imaging Using Bioorthogonal Chemistry in Mice. Curr. Opin. Chem. Biol. 21, 161-169 (2014).
- Denk, C., et al. Development of a 18F-Labeled Tetrazine with Favorable Pharmacokinetics for Bioorthogonal PET Imaging. Angew. Chem., Int. Ed. 53 (36), 9655-9659 (2014).
- Herth, M. M., Andersen, V. L., Lehel, S., Madsen, J., Knudsen, G. M., Kristensen, J. L. Development of a 11C-labeled Tetrazine for Rapid Tetrazine-Trans-Cyclooctene Ligation. Chem. Commun. 49 (36), 3805-3807 (2013).
- Li, Z., et al. Tetrazine-Trans-Cyclooctene Ligation for the Rapid Construction of 18F Labeled Probes. Chem. Commun. 46 (42), 8043 (2010).
- Nichols, B., Qin, Z., Yang, J., Vera, D. R., Devaraj, N. K. 68Ga Chelating Bioorthogonal Tetrazine Polymers for the Multistep Labeling of Cancer Biomarkers. Chem. Commun. 50 (40), 5215-5217 (2014).
- Zeglis, B. M., et al. A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. J. Nucl. Med. 54 (8), 1389-1396 (2013).
- García, M. F., et al. 99mTc-Bioorthogonal Click Chemistry Reagent for In Vivo Pretargeted Imaging. Bioorg. Med. Chem. 24 (6), 1209-1215 (2016).
- Russell, R. G. G. Bisphosphonates: The First 40 Years. Bone. 49 (1), 2-19 (2011).
- Yazdani, A., et al. A Bone-Seeking Trans-Cyclooctene for Pretargeting and Bioorthogonal Chemistry: A Proof of Concept Study Using 99mTc and 177Lu-Labeled Tetrazines. J. Med. Chem. , (2016).
- Alberto, R., et al. A Novel Organometallic Aqua Complex of Technetium for the Labeling of Biomolecules: Synthesis of [99mTc(OH2)3(CO)3]+ from [99mTcO4]- in Aqueous Solution and its Reaction with a Bifunctional Ligand. J. Am. Chem. Soc. 120 (31), 7987-7988 (1998).
- Alberto, R., Ortner, K., Wheatley, N., Schibli, R., Schubiger, A. P. Synthesis and properties of boranocarbonate: A convenient in situ CO source for the aqueous preparation of [99mTc(OH2)3(CO)3. J. Am. Chem. Soc. 123 (13), 3135-3136 (2001).
- Lu, G., et al. Synthesis and SAR of 99mTc/Re-labeled Small Molecule Prostate Specific Membrane Antigen Inhibitors with Novel Polar Chelates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1557-1563 (2013).
- Maresca, K. P., et al. Small Molecule Inhibitors of PSMA Incorporating Technetium-99m for Imaging Prostate Cancer: Effects of Chelate Design on Pharmacokinetics. Inorg. Chim. Acta. 389, 168-175 (2012).
- Bartholomä, M. D., et al. Insight into the Mode of Action of Re(CO)3 Thymidine Complexes. ChemMedChem. 5 (9), 1513-1529 (2010).
