Summary

비 침습적<em> In Vivo</em> 활성화 가능한 형광 이미징 에이전트를 사용한 염증성 MMP 활성의 형광 광학 이미징

Published: May 08, 2017
doi:

Summary

이 논문은 염증의 두 가지 실험 모델에서 키 매트릭스 메탈의 생체 내 활성을 시각화 기동 광학 이미징 프로브를 사용하여 형광 이미지의 적용을 설명한다.

Abstract

이 논문은 서로 다른 2 가지 마우스 염증 모델 인 류마티스 관절염 (RA)과 접촉 한 생체 내 형광 광학 이미징 (OI) 을 통해 활성화 가능한 형광 프로브에 의한 매트릭스 금속 단백질 분해 효소 (MMP) – 활성을 영상화하는 비 침습적 인 방법을 설명합니다 과민 반응 (CHR) 모델. 근적외선 (NIR) 창 (650 – 950 nm)의 파장을 갖는 빛은 650 nm 이하의 파장에 비해 깊은 조직 침투와 최소한의 신호 흡수를 허용합니다. 형광 OI를 사용하는 주요 이점은 다른 동물 모델에서 저렴하고 빠르고 쉽게 구현할 수 있다는 것입니다.

활성화 가능한 형광성 프로브는 비활성 상태에서는 광학적으로 침묵하지만 프로테아제에 의해 활성화되면 높은 형광성을 갖습니다. 활성화 된 MMP는 조직 파괴를 일으키고 RA 및 CHR과 같은 지연 형 과민 반응 (DTHR)에서 질병 진행에 중요한 역할을합니다. 또한 MMP는연골 및 뼈의 파괴와의 키 프로테아제 – 염증성 사이토 카인에 반응 대 식세포, 섬유 아세포 및 연골 세포에 의해 유발된다. 여기뿐만 아니라 질병의 유도 후 6 일 MMP-2, -3 같은 키 MMP의 활성화되어 프로브, -13 및 -13를 사용하여 근처 RA에서 MMP 활성의 적외선 형광 OI 및 대조군 마우스에 대한 촬상 프로토콜을 기술 급성 (1 배 도전)과 만성 건강한 귀에 비해 오른쪽 손잡이 (5 배 도전) CHR와 마우스에있다.

Introduction

류마티스 성 관절염 (RA)이나 건선의 건선과 같은자가 면역 질환은 지연 형 과민 반응 (DTHR)으로 분류됩니다. 1 RA는 부식성 윤 활막염과 관절 파괴를 특징으로하는 일반적인자가 면역 질환입니다. 염증 세포의 침투와 증식, 염증 세포의 발현 증가로 판 누스 형성, 연골 및 뼈 파괴를 일으키는 염증 관절염 관절. matrix metalloproteinases (MMPs)에 의한 콜라겐과 같은 세포 외 기질 분자의 절단은 조직 전환과 혈관 신생에 필수적이며 조직 파괴를 유발합니다. 5 , 6 접촉 과민 반응 (CHR)은 호중구가 응집되어 산화가 일어난다는 특징이 있습니다. RA와 유사하게 CHR의 MMP는 변이 형이다만성 염증을 설정하기 위해 조직 변환, 세포의 이동과 혈관 신생에 VED.

RA를 조사하기 위해, 글루코스 -6- 포스페이트 이소 머라 제 (GPI) -serum 주입 마우스 모델을 사용 하였다. GPI에 대한 항체를 포함하는 트랜스 제닉 K / BxN 마우스 8 혈청 류마티스 염증 GPI 혈청 주입 후 6 일째에 부은 발목 최대 24 시간 (1.1 참조)에서 개발하기 시작 후 나이브 BALB / c 마우스에 주입 하였다. 만성 CHR을 분석하기 위해, C57BL / 6 마우스는 복부에 trinitrochlorobenzene (TNCB)에 민감했다. 오른쪽 귀는 감작 후 일주를 시작하기 5 회까지 도전되었다 (도 1.1 및 1.2 참조).

비침 작은 동물 OI 주로 임상 연구에서 사용되어, 직관 형 형광등 chemiluminescent- 및 생물 발광-신호의 생체 내 연구에 기초한 기술이다. 취득한 반 정량적 데이터는 molec에 대한 통찰력을 제공합니다울라 기관의 메커니즘과 건강의 조직뿐만 아니라 병에 걸린 실험 동물 모델 및 측정을 따라 길이 방향의 수 (예를 들어 생체 내에서 치료 반응 프로파일을 평가하기 위해). 같은 동물이 아닌 시점에 따라 다른 마우스를 사용하는 여러 시점에서 후속 연구에서 측정 할 수있는 종 연구의 큰 장점은 동물 수의 감소이다. OI의 해상도는 기관의 상세한 기능 이미징 및 실험 동물에서 더 작은 조직 구조를 할 수 있습니다.

-70 ° C까지 많은 장치에서 냉각되어 좁은 투과 스펙트럼, A A 차광판에 의해 산란 빛으로부터 보호 "어두운 박스"및 대전 성 결합 소자 (CCD) 카메라와 특정한 여기 및 방사 필터를 사용 매우 특정한 수 있고 형광 신호 민감한 측정.

excitation-과 함께 형광 제를 사용하여근적외선 형광 창 (650 – 950 nm)의 방출 스펙트럼에서 신호 대 잡음비가 크게 향상 될 수 있습니다. 근적외선 형광 창은 헤모글로빈과 물에 의한 신호 흡수가 상대적으로 낮을뿐만 아니라 배경 자동 자기장이 낮다는 특징이 있습니다. 9 이것은 작은 동물의 조직에서 2cm까지 침투 깊이를 허용합니다. OI- 프로브는 표적 조직을 직접 ( 예 : 형광 표지 된 항체에 의해) 처리하거나 표적 조직에서 활성화시킬 수 있습니다 ( 예 : 프로테아제). 활성화 가능한 OI 프로브는 Förster 공명 에너지 전달 (FRET)으로 인해 비활성화 된 형태로 광학적으로 침묵하며, 이는 분자 내의 여기 에너지를 다른 영역으로 이동시키는 퀀칭 부분 (quenching moiety)으로 향하게됩니다. 염료가 (예를 들어 프로테아제에 의해) 절단되면, 에너지는 더 이상 분자 내에서 전달되지 않으며, 형광 신호는 OI에 의해 검출 될 수있다. 이것은 높은 특이성을 갖는 OI 프로브의 설계를 허용합니다뚜렷한 생물학적 과정과 탁월한 신호 대 잡음비.

다음 프로토콜은 동물의 준비, 생체 내에서 MMP-2, -3, -9 및 -13 활성 및 염증의 두 실험 모델 (RA, CHR)을 이미지화하기 위해 Activatable OI 프로브를 사용하여 OI 측정을 자세히 설명합니다.

Protocol

이 문서에 설명 된 모든 절차는 지침과 관리 및 실험 동물의 사용의 국제 표준을 따라 국가위원회 튀빙겐, 독일의 지역 동물 복지와 윤리위원회에 의해 승인되었다. 12 시간 광 : – 8 ~ 12 주령 BALB / C 및 C57BL / 6 마우스는 12 시간에 보관 하였다 암주기를 2 그룹으로 22 ± 1 ℃에서 IVCs 표준화 된 환경 조건에 수납 된 – 물 (5) 음식 액세스 수의. 1. 재료 준비 사출 직전 ?…

Representative Results

경구 용 BALB / c 마우스에서 류마티스 성 관절염 (RA)을 유도하기 위해, 동물에게 0 일째에 GPI에 대한자가 항체 (1x PBS로 1 : 1로 희석)를 주사 하였다.이 GPI- 혈청에서 최대 염증 (발목 부종) RA 모델은 주사 후 6 일째 날 11에 있다. 따라서, 2 nmol의 활성화 가능한 OI 염료가 준비되었고 5 일째에 관절염 마우스 및 건강한 대조 동물의 꼬리 정맥에 주사되었다. 주사…

Discussion

OI는 전임상 연구 에서 비 침습적 생체 내 분자 이미징을위한 매우 유용하고 빠르며 저렴한 도구입니다. OI의 특별한 강점은 염증 반응과 같은 매우 역동적 인 과정을 모니터하는 능력입니다. 또한 OI는 수 일에서 수주에 이르는 장기간의 질병 경과를 추적 할 수있게 해줍니다.

OI는 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 또는 자기 공명 영상 (MRI)과 같은 다른 생체 내

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

탁월한 기술 지원에 대해 Daniel Bukala, Natalie Altmeyer 및 Funda Cay에게 감사드립니다. 원고를 편집 한 Jonathan Cotton, Greg Bowden 및 Paul Soubiran에게 감사드립니다. 이 작업은 Werner Siemens-Foundation과 Eberhard Karls University Tübingen의 의학 교수 ( "Promotionskolleg") 및 CRC 156 (프로젝트 C3)을 통한 DFG의 지원을 받았다.

Materials

Cornergel Gerhard Mann GmbH 1224635 ophthalmic ointment 
Forene Abbott GmbH 4831850 isoflurane
U40 insulin syringe Becton Dickinson and Company 324876
Heparin Sintetica 6093089
High-Med-PE 0.28×0.61mm Reichelt Chemietechnik GmbH+Co 28460 polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm 
BD Regular Bevel Needles, 30 G Becton Dickinson & Co. Ltd. 305106 30 G injection cannula
RTA-0011 isoflurane vaporizer Vetland Medical Sales and Services LLC
Artagain drawing paper Strathmore Artist Paper 446-8 coal black
IVIS Spectrum Perkin Elmer 124262 Optical imaging system
BD Regular Bevel Needles, 25 G Becton Dickinson and Company 305122
2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene Sigma Aldrich GmbH 7987456F TNCB
MMPSense 680 Perkin Elmer  NEV10126 fluorescent imaging dye
Oditest  Koreplin GmbH C1X018 mechanical measurment
Miglyol 812 SASOL Oil
 BALB/C, C57BL/6 Charles River Laboratories  Mice used for experiements
PBS Sigma Aldrich GmbH For dilution of the RA serum 
Pipette (100µl) Eppendorf  Used for TNCB application 
shaver  Wahl  9962 Animal hair trimmer
Living Image  Perkin Elmer  Imaging software to measure OI

References

  1. Veale, D. J., Ritchlin, C., FitzGerald, O. Immunopathology of psoriasis and psoriatic arthritis. Ann Rheum Dis. 64, 26 (2005).
  2. Harris, E. D. Rheumatoid arthritis. Pathophysiology and implications for therapy. N Engl J Med. 322 (18), 1277-1289 (1990).
  3. Lee, D. M., Weinblatt, M. E. Rheumatoid arthritis. Lancet. 358 (9285), 903-911 (2001).
  4. Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. J Clin Rheumatol. 11, S39-S44 (2005).
  5. Pap, T., et al. Differential expression pattern of membrane-type matrix metalloproteinases in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 43 (6), 1226-1232 (2000).
  6. Firestein, G. S., Paine, M. M. Stromelysin and tissue inhibitor of metalloproteinases gene expression in rheumatoid arthritis synovium. Am J Pathol. 140 (6), 1309-1314 (1992).
  7. Schwenck, J., et al. In vivo optical imaging of matrix metalloproteinase activity detects acute and chronic contact hypersensitivity reactions and enables monitoring of the antiinflammatory effects of N-acetylcysteine. Mol Imaging. 13, (2014).
  8. Monach, P. A., Mathis, D., Benoist, C. The K/BxN arthritis model. Curr Protoc Immunol. 15, 22 (2008).
  9. Zelmer, A., Ward, T. H. Noninvasive fluorescence imaging of small animals. J Microsc. 252 (1), 8-15 (2013).
  10. Kouskoff, V., et al. Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity. Cell. 87 (5), 811-822 (1996).
  11. Fuchs, K., et al. In vivo imaging of cell proliferation enables the detection of the extent of experimental rheumatoid arthritis by 3′-deoxy-3′-18f-fluorothymidine and small-animal PET. J Nucl Med. 54 (1), 151-158 (2013).
  12. Schwenck, J., et al. Fluorescence and Cerenkov luminescence imaging. Applications in small animal research. Nuklearmedizin. 55 (2), 63-70 (2016).
  13. Mahling, M., et al. A Comparative pO2 Probe and [18F]-Fluoro-Azomycinarabino-Furanoside ([18F]FAZA) PET Study Reveals Anesthesia-Induced Impairment of Oxygenation and Perfusion in Tumor and Muscle. PLoS One. 10 (4), 0124665 (2015).
  14. Fuchs, K., et al. Oxygen breathing affects 3′-deoxy-3′-18F-fluorothymidine uptake in mouse models of arthritis and cancer. J Nucl Med. 53 (5), 823-830 (2012).
  15. Fuchs, K., et al. Impact of anesthetics on 3′-[18F]fluoro-3′-deoxythymidine ([18F]FLT) uptake in animal models of cancer and inflammation. Mol Imaging. 12 (5), 277-287 (2013).
  16. Liu, N., Shang, J., Tian, F., Nishi, H., Abe, K. In vivo optical imaging for evaluating the efficacy of edaravone after transient cerebral ischemia in mice. Brain Res. 1397, 66-75 (2011).
  17. Sheth, R. A., Maricevich, M., Mahmood, U. In vivo optical molecular imaging of matrix metalloproteinase activity in abdominal aortic aneurysms correlates with treatment effects on growth rate. Atherosclerosis. 212 (1), 181-187 (2010).
  18. Chen, J., et al. Near-infrared fluorescent imaging of matrix metalloproteinase activity after myocardial infarction. Circulation. 111 (14), 1800-1805 (2005).
  19. Wallis de Vries, B. M., et al. Images in cardiovascular medicine. Multispectral near-infrared fluorescence molecular imaging of matrix metalloproteinases in a human carotid plaque using a matrix-degrading metalloproteinase-sensitive activatable fluorescent probe. Circulation. 119 (20), e534-e536 (2009).
  20. Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).
  21. Cortez-Retamozo, V., et al. Real-time assessment of inflammation and treatment response in a mouse model of allergic airway inflammation. J Clin Invest. 118 (12), 4058-4066 (2008).
  22. McIntyre, J. O., et al. Development of a novel fluorogenic proteolytic beacon for in vivo detection and imaging of tumour-associated matrix metalloproteinase-7 activity. Biochem J. 377, 617-628 (2004).
  23. Scherer, R. L., VanSaun, M. N., McIntyre, J. O., Matrisian, L. M. Optical imaging of matrix metalloproteinase-7 activity in vivo using a proteolytic nanobeacon). Mol Imaging. 7 (3), 118-131 (2008).
  24. Olson, E. S., et al. In vivo characterization of activatable cell penetrating peptides for targeting protease activity in cancer. Integr Biol (Camb. 1 (5-6), 382-393 (2009).
  25. Duijnhoven, S. M., Robillard, M. S., Nicolay, K., Grull, H. Tumor targeting of MMP-2/9 activatable cell-penetrating imaging probes is caused by tumor-independent activation). J Nucl Med. 52 (2), 279-286 (2011).
  26. Schafers, M., Schober, O., Hermann, S. Matrix-metalloproteinases as imaging targets for inflammatory activity in atherosclerotic plaques. J Nucl Med. 51 (5), 663-666 (2010).
  27. Wagner, S., et al. A new 18F-labelled derivative of the MMP inhibitor CGS 27023A for PET: radiosynthesis and initial small-animal PET studies. Appl Radiat Isot. 67 (4), 606-610 (2009).
  28. Waschkau, B., Faust, A., Schafers, M., Bremer, C. Performance of a new fluorescence-labeled MMP inhibitor to image tumor MMP activity in vivo in comparison to an MMP-activatable probe. Contrast Media Mol Imaging. 8 (1), 1-11 (2013).
  29. Vogl, T., et al. Alarmin S100A8/S100A9 as a biomarker for molecular imaging of local inflammatory activity. Nat Commun. 5, 4593 (2014).

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Schwenck, J., Maier, F. C., Kneilling, M., Wiehr, S., Fuchs, K. Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent. J. Vis. Exp. (123), e55180, doi:10.3791/55180 (2017).

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