Genomweite Bestimmung der Mammalian Replication-Timing von Inhaltsmessung DNA

Mammalian DNA-Replikation ist streng reguliert die exakte Replikation jedes Chromosoms während des Zellzyklus genau einmal zu gewährleisten. Die Replikation erfolgt gemäß einem stark regulierten Ordnung – mehrere große genomischen Regionen (~ Mb) zu Beginn der S – Phase repliziert (frühe Domänen replizieren) , während andere Genomregionen später bei mittleren oder späten S – Phase (Mitte und Ende der replizierenden Domänen) replizieren ^1. Der größte Teil des Genoms repliziert zur gleichen Zeit in allen Geweben (konstitutive ToR Domänen), während die 30% – 50% des Genoms, ändert seine ToR zwischen Geweben ^2, während der Differenzierung ^{3, 4} und in geringerem Maße auch während der Krebstransformation ⁵ . Darüber hinaus sind bestimmte replizieren genomischen Regionen asynchron ^{6, 7, 8,} nämlich ein Unterschied bestehtin den ToR zwischen den beiden Allelen.

ToR korreliert mit vielen genomischen und epigenomischen Funktionen , einschließlich der Transkription Ebenen, GC – Gehalt, Chromatinzustand, Gendichte, usw. ^{1, 9.} ToR ist auch mit Mutationsraten und Typen zugeordnet sind ^{10, 11} und daher wenig überraschend, Störungen des Replikationsprogramms an Krebs ^12, verbunden ^13. Der kausale Zusammenhang zwischen ToR und Chromatinstruktur ist noch nicht verstanden. Es ist möglich, dass offene Chromatin frühen Replikation ermöglicht. Jedoch schlägt ein alternatives Modell , dass das Chromatin während der Replikation und die verschiedenen Chromatin – Regulatoren am Anfang und Ende der S Phasenvoreilung Verpackung Differentials der frühen und späten replizierende Regionen ^{1, 14} zusammengesetzt ist </sup>. Wir haben kürzlich gezeigt , dass die ToR formt den GC – Gehalt durch die Art der Mutationen betreffen , die ¹¹ in verschiedenen genomischen Regionen auftreten.

Fluoreszenz – in – situ – Hybridisierung (FISH) ist die wichtigste Methode für ToR an einzelnen Loci zu messen. Es wird durchgeführt , indem einfach der Prozentsatz von S – Phasen – Zellen zu zählen , die einzelne FISH – Signale gegen den Prozentsatz der Dubletten für ein bestimmtes Allel ^{15, 16} aufweisen. Ein alternatives Verfahren besteht aus Impuls mit BrdU die DNA – Markierung, ¹⁷ Zellen entsprechend ihrem DNA – Gehalt zu mehreren Zeitpunkten längs S, Immunpräzipitation DNA enthält BrdU und Überprüfung der Fülle von gefällter DNA mit qPCR Sortierung.

Genomic ToR Zuordnung kann durch zwei Methoden erreicht werden. Die erste Methode ist eine genomische Version des BrdU-IP basierten oben beschriebenen Verfahren, bei dem die Quantifizierung der Mengevon gefällte DNA in jeder Fraktion wird gleichzeitig für das gesamte Genom durch Hybridisierung mit Microarrays oder durch tiefe Sequenzierung durchgeführt. Die zweite Methode, CNR-TOR, basiert die Kopienzahl jeder genomischen Region von S-Phasen-Zellen und Normalisierung durch den DNA-Gehalt in Zellen G1 zu messen. Bei diesem Verfahren werden die Zellen durch FACS in nicht-replizierenden (G1 – Phase) und Replizieren (S – Phase) Gruppen (1) sortiert. Zellen in G1 haben die gleiche Kopienzahl in allen genomischen Regionen und somit sollten ihren DNA-Gehalt gleich sein. Auf der anderen Seite hängt die DNA-Kopienzahl in S auf der ToR, seit Anfang replizierende Regionen unterzog Replikation in den meisten Zellen und wird daher ihre DNA-Gehalt verdoppelt, während spät replizierende Regionen noch nicht in den meisten Zellen repliziert wurden und damit deren DNA-Gehalt werden dem von G1-Zellen ähnlich. Daraus ergibt sich die S G1 Verhältnis von DNA-Gehalt der ToR indikativ. Die Menge an DNA für jeden genomischen Region wird entweder durch Hybridisierung gemessenMicroarrays oder durch tiefe Sequenzierung ^{2, 8.} Die Vorteile des CNR-TOR Verfahren wird weiter diskutiert.

Dieses Papier beschreibt die CNR-ToR Verfahren zur genomischen ToR – Mapping , wie in Abbildung 2 beschrieben. Das Papier beschreibt die feinen Details des gesamten Prozesses von Zellen, bis die grundlegenden Analyse der Ergebnisse und der Erstellung von genomischen ToR Karten zu sammeln. Das Protokoll in diesem Papier beschrieben wurde auf verschiedenen Zelltypen in Kultur gezüchtet erfolgreich durchgeführt. Zukünftige Verbesserungen dieses Protokolls können in vivo zu der Abbildung des ToR führen und in seltenen Zelltypen.