Svelare la funzione di un batterica Effector da un non-coltivabili fitopatogeni Utilizzando un lievito schermo doppio ibrido

1. Raccolta radice e foglia di campioni da alberi di mele infette Nota: DNA del patogeno-specifica può essere purificato dalle radici o foglie. La sezione seguente fornisce un protocollo per il campionamento di entrambi. Per la preparazione del DNA Raccolta dei campioni e preparazione dalle radici Identificare gli alberi infetti con "Apple proliferation" sintomi specifico d'30, 31 e gli alberi di controllo che sono senza sintomi. Utilizzando forbici pulite, tagliare campioni radice che hanno un diametro di 0,5 – 1 cm e una lunghezza di circa 5 cm. I campioni tagliati dalla tre diversi, i siti distanti del sistema radicale, e metterli in sacchetti di plastica adeguatamente etichettati. Conservare i campioni in una scatola fredda con pacchetti termali refrigerati e conservarli in frigorifero a 4 ° C, fino al procedimento. Nota: l'architettura e la struttura della radice può variare rispetto allo stato fisiologico of l'albero. È importante campionare a tre siti diversi e non prendere radichette troppo sottili. I campioni possono essere conservati per diversi giorni a 4 ° C, ma i tempi di inattività aumentano il rischio di stampaggio. campioni Moldy non possono essere utilizzati per la preparazione del DNA. Risciacquare i campioni radicolari con acqua per rimuovere il terreno. Metteteli in una capsula di Petri sterile e usare un bisturi sterilizzato per rimuovere l'epidermide radice e la corteccia. Pulire il bisturi con un panno pulito e privo di lanugine pulire, immergerlo nel 70% (v / v) di acqua di etanolo, e il calore-sterilizzare sopra una fiamma aperta (ad esempio, becco Bunsen). Gratta il floema con il bisturi, tagliare in piccoli pezzi, e un'aliquota di 30 – 100 mg di floema tritato in un tubo di reazione 2,0 ml sterile. Conservare i campioni a -80 ° C per diversi mesi. la raccolta e la preparazione di foglie di esempio Identificare un infetto e un albero di controllo asintomatico, unas descritto al punto 1.1.1.1, e raccogliere dieci foglie indenne per albero. Un albero per ogni condizione è sufficiente. Lavare le foglie con acqua e pulire le superfici a spruzzo 70% (v / v) di etanolo. Mettere le foglie in una capsula di Petri sterile e sezionare la nervatura centrale (vena centrale) di ogni foglia con un bisturi sterile. Rimuovere l'epidermide e la corteccia dalla nervatura centrale, tagliare la nervatura centrale in piccoli pezzi, e un'aliquota di 100 mg del tessuto nervatura centrale in un tubo di reazione da 2,0 ml sterile. Utilizzare i campioni immediatamente per la preparazione del DNA o conservare a -80 ° C per diversi mesi. Nota: È conveniente Aliquotare il materiale vegetale in porzioni di 100 mg ed eventualmente congelarli per la conservazione. Ogni aliquota può essere utilizzato direttamente per la preparazione del DNA. Pesatura materiale vegetale surgelati è ingombrante, poiché il materiale vegetale congelato tende a formare blocchi. 2. cetiltrimetilammonio bromuro (CTAB) a base di DNA Preparazione <p class = "jove_content"> Nota: il DNA può essere purificato con qualsiasi metodo di purificazione del DNA basata su colonne di materiale vegetale. In questa sezione, un metodo CTAB-based per la purificazione del DNA è descritto. Purificazione del DNA viene eseguito in base ad un protocollo modificato descritto altrove 32. Preparare i seguenti tamponi: Tampone CTAB: Sciogliere 1% w / v cetiltrimetilammonio bromuro (CTAB, M r: 364,45 g / mol), 100 mM tris-idrossimetilamminometano (Tris, M r: 121.14 g / mL), 1,4 M di cloruro di sodio (NaCl, M r: 58,44 g / mol), e 20 mm etilendiamminotetraacetico sale disodio (L 'NaEDTA, M R: 372,24 g / mol) in acqua e ad adattarsi a pH 8.0. N-Lauroylsarcosine buffer: Sciogliere 10% w / v sale di sodio N-lauroylsarcosine 33 (M r: 293,38 g / mol), 100 mM Tris, e 20 mM L 'NaEDTA in acqua e regolare il pH a 8,0. Tris-EDTA (TE) buffer: Sciogliere 10 mM Tris e 1 mM L 'NaEDTA in acqua e autoclave la soluzione. Soluzione di acetato di ammonio: Preparare un 5 M di acetato di ammonio (M r: 77,0825 g / mol) soluzione in acqua e autoclave è a 120 ° C e 1,2 bar per 20 min. Mix 30 – 100 mg di materiale vegetale tritato fresco o surgelato (passo 1.1.2.2.) Con 300 ml di tampone CTAB, 30 ml di tampone N-Lauroylsarcosine, 6 ml di proteinasi K (10 mg / mL) e 12 ml di 2-mercaptoetanolo 34 (M r: 78,13 g / mol). Agitare per 60 min a 60 ° C. Lasciate che la miscela raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere. Aggiungere 360 ​​ml di soluzione di acetato di ammonio e mescolare energicamente. Sia la soluzione riposare per 5 minuti, quindi si centrifuga che a 15.000 xg per 10 min a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante in una provetta pulita e aggiungere 720 ml di ghiacciata isopropanolo 35. Precipitare il DNA per almeno 30 min a -20 ° C. Centrifugare la miscela a 15.000 xg per 30 min a 4° C e scartare il surnatante. Lavare il pellet con 500 ml di ghiacciata etanolo al 70% e spin giù a 15.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante etanolo e immergere immediatamente il flaconcino su un tovagliolo di carta pulito per rimuovere le goccioline residue. Assicurarsi di rimuovere quanto più liquido possibile. Far asciugare il pellet per 15-20 minuti o per 2-3 minuti in una centrifuga a vuoto concentratore. Non over-asciugare il pellet da tempi di evaporazione estesi riscaldamento eccesso o. Risospendere il pellet in 700 ml di tampone TE e infine scaldare a 37 ° C per facilitare la dissoluzione. Aggiungere 10 ml di RNAsi (10 mg / mL) e incubare per 15 min a 37 ° C, agitando a 300 rpm. Aggiungere 700 ml di cloroformio: alcool isoamilico 36 24: 1 e mescolare bene. Centrifugare la miscela a 20.000 xg per 10 min a 4 ° C e trasferire la fase superiore del surnatante in una nuova provetta pulita. Precipitare il DNA nel surnatante aggiungendo700 ml di 2-propanolo 35 (isopropanolo, M r: 60.1 g / mol) e incubando per almeno 30 min a -20 ° C. Centrifugare la miscela a 12.000 xg per 30 min a 4 ° C e scartare il surnatante. Lavare il pellet con 500 microlitri di etanolo al 70% e centrifugare a 12.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Asciugare il pellet come descritto al punto 2.5. Sciogliere in 50 ml di TE. 3. Individuare Candidatus Phytoplasma DNA mali-specifica mediante PCR Diluire il DNA purificato dal materiale vegetale 1:10 in acqua priva di nucleasi ed eseguire una PCR con primer specifici patogeni 37. Verificare la presenza di P. DNA specifiche mali nel materiale vegetale utilizzando un protocollo quantitativa PCR con primer e sonde specifiche per P. fitoplasmi mali 37. Controllare l'assenza degli altri membri fitoplasmi 16SrX eseguendo la stessa PCR con le rispettive sonde per CaND. P. prunorum e per Cand. P. pyri DNA 37. NOTA: DNA da un albero non infetto deve essere testato anche per confermare l'assenza di un agente patogeno in questo controllo. A questo punto, è importante che il DNA da altre specie strettamente correlate fitoplasmi è assente nel campione, poiché ciò aumenta il rischio di amplificare l'effettore da una specie fitoplasmi diversi da P. mali. Una infezione mista con un altro strettamente correlato P. mali gruppo fitoplasmi 16SrX è escluso analizzando il campione con le rispettive sonde. Poiché i risultati attesi dovrebbero essere negativa per altri phytoplasma 16SrX, è importante includere i controlli appropriati positivi che indicano PCR efficacia. 4. amplificando il potenziale Effector Gene e subcloning nel vettore Y2H Bait Amplificare il gene atp_00189 phytoplasmal (che non comprende la parte del segnale peptide) di P. Mali utilizzando i primer 5-TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA-3 (in avanti) e 5-TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT-3 (reverse), con siti di restrizione per EcoRI e SalI al 5 'e al 3' estremità, rispettivamente. Purificare il prodotto di PCR con un metodo di purificazione di DNA basata su colonne. Clonare il amplicone nel vettore Y2H esca PLEXA-N tramite EcoRI e SalI legatura. NOTA: Qui, 100 ng di EcoRI e SalI linearizzato PLEXA-N vettore è stato combinato con 15 ng di simile digerito atp_00189 PCR amplicone e 1 U di T4-ligasi. La legatura è stata effettuata in tampone contenente 40 mM Tris-HCl (pH 7,9 a 25 ° C), 10 mM MgCl 2, 10 mM ditiotreitolo (DTT, M r: 154.25 g / mol), e 0,5 mM adenosina trifosfato (ATP, M r: 507,18 g / mol) in un volume totale di 10,0 microlitri a 16 ° C per una notte (14-20 h). Analizzare il DNA dall'albero non infetto con gli stessi primer per escludere fondo non specifico legame con Malus domestica x </ Em> DNA. Transform 1 ml di miscela di legamento in cellule di E. coli electrocompetent e selezionare per i cloni resistenti kanamicina su Luria-Bertani (LB) piastre integrato con 50 mg / ml kanamicina solfato 38. Purificare il DNA plasmide dai cloni batterici selezionati con un mini kit di preparazione plasmide colonna a base seguendo le istruzioni del produttore, e controllare la riuscita integrazione e l'orientamento dell'inserto mediante sequenziamento 39. 5. Prova di auto-attivazione (Auto-attivazione) della proteina potenziale Effector Preparare i seguenti tamponi e mezzi di crescita: NOTA: La nomenclatura per piatti divide le lievito-selettivo le abbreviazioni degli aminoacidi mancanti nella rispettiva media con un "-" prima della sigla. Ad esempio, SD-TRP-Leu-sue lastre contengono tutti gli amminoacidi, ma trp, leu e la sua. 10x dropout mix: Pesare200 mg di L-arginina monocloridrato (M r: 210,66 g / mol), 300 mg di L-isoleucina (M r: 131.17 g / mol), 269 mg di monoidrato L-lisina (M r: 164.21 g / mol), 200 mg di L-metionina (M r: 149.21 g / mol), 500 mg di L-fenilalanina (M r: 165,19 g / mol), 2 g di L-treonina (M r: 119.12 g / mol), 300 mg di L-tirosina (Mr: 181.19 g / mol), 200 mg di L-uracile (112.09 g / mol), e 1,5 g di L-valina (M r: 117.15 g / mol). li Sciogliere in 1 L di acqua bidistillata e autoclave la soluzione. Mantenere la soluzione a 4 ° C. NOTA: Il rispettivo mix di abbandono può essere premiscelato anche acquistati. 10x L-adenina supplemento: Pesare 100 mg di sale di L-adenina hemisulfate (ade, M r: 184.17 g / mol) e scioglierli in 50 ml di acqua bidistillata. Filtro sterilizzare la soluzione con un filtro pori 0,22 micron. 10x L-istidina supplemento: Pesare 100 mg di L-istidina monocloridrato monoidrato (il suo, M r </sub>: 209.63 g / mol) in 50 mL di acqua bidistillata e filtro sterilizzare con un filtro pori 0,22 micron. 10x L-leucina supplemento: Pesare 500 mg di L-leucina (Leu, M r: 113.17 g / mol) in 50 mL di acqua bidistillata e filtro sterilizzare con un filtro pori 0,22 micron. 10x L-triptofano supplemento: Pesare 100 mg di L-triptofano (trp, M r: 204.23 g / mol) in 50 mL di acqua bidistillata e filtro sterilizzare con un filtro pori 0,22 micron. SD-trp-leu-his-ade-media e piastre: Sciogliere 0,67% w / v base azotata di lievito (senza amminoacidi) e 2% w / v D-glucosio monoidrato (M r: 198,17 g / mol) in doppio acqua e autoclave distillata. Per piastre di agar, aggiungere 2% w / v di agar (grado microbiologica) prima di sterilizzazione in autoclave. Per preparare piatti selettive, aggiungere 1x del aminoacido soluzione madre al mezzo Sd-TRP-Leu-la-ade autoclave. Nel preparare lastre, assicurarsi che l'agar viene raffreddata a ~ 50 ° C prima di aggiungeregli aminoacidi. Conservare le soluzioni madre sterili. Media YPAD: sciogliere 1% w / v di estratto di lievito, 2% w / v peptone (grado microbiologica), 0,004% w / v adenina hemisulfate sale (M r: 184.17 g / mol), e 2% w / v di glucosio monoidrato per acqua e autoclave bidistillata. Per piastre di agar YPad, aggiungere 2% w / v di agar prima di sterilizzazione in autoclave. Per preparare 2x YPAD, utilizzare due volte le concentrazioni degli ingredienti di cui sopra. Nota: (opzionale) A causa della elevata concentrazione di glucosio nel mezzo, medio 2x YPAD diventa scuro-brunastro dopo la sterilizzazione in autoclave. In alternativa, un 40% (w / v) di soluzione di glucosio può essere preparato e sterilizzato facendolo passare attraverso un filtro di 0,22 micron. Il glucosio magazzino soluzione sterilizzata per filtrazione viene quindi aggiunto al autoclavato 2x YPAD (privo di glucosio) in condizioni sterili. Per evitare errori di volume, l'2x YPAD deve essere preparato, tenendo presente che una soluzione di glucosio 10x viene successivamente aggiunto. Ciò significa che, per esempio, invece di 1 L of media, solo 900 ml è preparato (che contiene tutti gli ingredienti tranne il glucosio) e sterilizzati in autoclave, e poi viene aggiunto 100 ml di soluzione di glucosio. trasformazione di lievito litio acetato-mediata per il test di auto-attivazione Streak il ceppo Saccharomyces cerevisiae giornalista NMY51 40 (NMY51: MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ADE2 LYS2: :( lexAop) 4 HIS3 URA3: :( lexAop) 8-lacZ ADE2: :( lexAop) 8-ADE2 GAL4) da un glicerolo congelati magazzino su una piastra di agar YPAD e incubare per 48 ore a 30 ° C. Scegliere colonie di questo piatto e inoculare 50 ml di terreno YPAD. Lasciate che il lievito crescere e misurare il diametro esterno 600 regolarmente per monitorare la crescita. Lasciate che il lievito a crescere ad un diametro finale 600 di 0,5-0,8. Agglomerare le cellule da essi centrifugazione a 700 xg per 5 minuti e risospendere in 2,5 ml di acqua bidistillata, autoclave. Preparare sei aliquote con 100 ml di sospensione di lievito e aggiungere 240 ml di 50% W / v polietilenglicole 4000 (PEG, M r: 3.500-4.000 g / mol), 36 ml di 1 M di litio acetato diidrato (LiOAc, M r: 102.02 g / mol), e 25 ml di 2% w / v DNA dello sperma di salmone (disciolto). Preparare tutti i reagenti con acqua bidistillata sterile. Etichettare i sei fiale contenenti la sospensione di lievito da "a" a "f" e aggiungere il seguente DNA plasmide vettore: controlli negativi: (a) 1,5 mg di esche plasmide con il effettrici (Plexa-N-atp00189 28), (b) 1,5 mg di plasmide preda vuoto PGAD-HA 41, (c) 1.5 mg di vettore esca vuoto PLEXA-N 41, e (d) 1,5 mg di esche vettore vuoto PLEXA-N e 1,5 mg di vuoto preda plasmide PGAD-HA; controlli positivi: (e) 1,5 mg di positivo-controllo esca plasmide DNA PLEXA-p53 41 e 1,5 mg di positivo-preda plasmide PACT-larget 41; e il test di auto-attivazione: (f) 1,5 mg di baesso plasmide con il effettrici (Plexa-N-atp00189) e 1,5 mg di vuoto preda plasmide PGAD-HA. Mescolare le reazioni vigorosamente e incubare per 45 min a 42 ° C in un bagno d'acqua. Agglomerare le cellule per 5 minuti a 700 xg ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in 250 ml di 0,9% (w / v) di cloruro di sodio (NaCl, M r: 48.44 g / mol) e la diffusione 50 microlitri sui seguenti piastre selettive: SD-trp, Sd-leu, SD-trp- leu, SD-TRP-Leu-la, e SD-TRP-Leu-la-Ade. Incubare le piastre per 3 – 4 giorni a 30 ° C. Dopo il primo giorno di incubazione, sigillare le piastre con parafilm plastica per evitare che le piastre si secchi. Controllare la crescita del lievito sulle piastre. 6. Verificare l'espressione del Effector Testare l'espressione del effettore mediante Western blot 42 con un anticorpo contro la Lex-A tag che è accoppiato al N-terminale della effettore quandoespresso da PLEXA-N. Nota: Si consideri che il translationally fuso Lex-Un tag aggiunge circa 24 kDa al peso effettivo della proteina di interesse. Questo è importante quando si identifica la dimensione proteina nel Western blot. 7. La schermata Y2H Streak il PLEXA-atp00189 (attuatore) -transformed NMY51 su un piatto SD-trp fresco e lasciarlo crescere per 2 – 3 giorni a 30 ° C, fino a quando appaiono colonie rosse. Seminare 3 mL di terreno SD-trp in una piccola boccetta agitando con una colonia rossa dalla piastra agar e incubare una notte a 30 ° C con agitazione a 120 – 150 rpm. Inoculare 20 mL di SD-trp in un pallone agitazione con 1 ml di cultura durante la notte e lasciarlo crescere per 8 ore. Regolare la cultura di OD 600 = 0,2 con l'aggiunta di media SD-trp e inoculare 2x 100 ml in agitazione boccette con 10 ml di coltura starter ciascuno. Crescere durante la notte con agitazione a 30 ° C. Nota: Assicurarsi che il lievito non cresce a OD 600> 0.5 e diluire con fresca SD-trp. Misurare il diametro esterno 600 e il pellet 120 OD 600 "unità". Ad esempio, se un OD 600 di 1,2 è misurata, centrifugare 100 mL, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 800 ml di pre-riscaldato 2x YPAD in un pallone shaker con ancoretta magnetica. Spin giù una aliquota di 2 ml, togliere il surnatante, e risospendere il pellet in acqua. Assicurarsi che il diametro esterno 600 della sospensione di lievito è compresa tra 0,15 e 0,2. In caso contrario, regolare con 2x YPAD o aggiungere più lievito dalla cultura durante la notte. Nota: 2x YPAD è marrone scuro e può influenzare i risultati della misurazione OD. Pertanto, è necessario per risospendere le cellule di lievito in acqua prima di determinare il OD. In alternativa, 2x YPAD può essere preparato mediante sterilizzazione glucosio separatamente, come descritto nel passaggio 5.1.8 nota, che impedisce la colorazione scura del mezzo. Incubare la cultura rimanente lievito in un appropriately dimensioni matraccio agitatore (800 mL in un matraccio agitatore 2 L o dividere 2 x 400 mL in due beute 1 L shaker) e incubare a 30 ° C 120 – 150 rpm. Misurare il diametro esterno 600 circa ogni 1,5 ore fino a quando un OD 600 di 0,6 viene raggiunta (prende 4 – 6 h). Nel frattempo preparare le soluzioni descritte nel passaggio successivo. Litio trasformazione acetato-mediata Sciogliere 2% w / v DNA di sperma di salmone in acqua e far bollire 500 microlitri per 5 minuti in un bagno d'acqua a 100 ° C. Posizionare la provetta in ghiaccio per 2 minuti e ripetere la fase di riscaldamento. Mantenere il DNA in ghiaccio fino a nuovo uso. Preparare le seguenti mescole: TE / LiOAC mix: Mescolare 3.08 ml di 1 M LiOAC, 3,08 ml di 100 mM Tris / 10 mM EDTA (pH: 7,5), e 21,84 ml di acqua bidistillata sterile. PEG / LiOAc mix: Combinare 4,2 mL di 1 M LiOAc, 4.2 mL di mM Tris / EDTA 10 mM (pH: 7,5), e 33,6 ml di 50% (w / v) di PEG 4000. Centrifuga la cultura di lievito 800 ml (OD 600 = 0,6)a 700 xg per 5 minuti per agglomerare le cellule. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 200 ml di acqua bidistillata sterile. Agglomerare le cellule di nuovo a 700 g per 5 minuti e scartare il surnatante. Nota: se necessario dividere la sospensione in diverse fiale per centrifugazione. I volumi liquidi in 7.7.3. e 7.7.4. riferirsi a tutta pellet derivato da 800 ml di sospensione. Risospendere il pellet in 16 ml di TE / LiOAc mix (vedi punto 7.7.1.1); spin down a 700 xg per 5 minuti e scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 9,6 ml di TE / LiOAC mix. Preparare la seguente reazione si mescola in modo appropriato dimensioni vasi reazione polipropilene: 12 fiale con 7 mg di PGAD-HA-cDNA vettore biblioteca, 100 ml di 2% del DNA dello sperma di salmone (vedi punto 7.7) e 2,5 ml di PEG / LiOAc mix. Aggiungere 600 microlitri di sospensione cellulare di lievito dal passo 7.10 a ciascuno dei 12 fiale e mescolare vigorosamente per 1 min. Incubare la miscela di reazione per 45 minuti a 30 ° C in un bagno d'acquad mescolare energicamente ogni 15 min. Aggiungere 160 ml di DMSO ad ogni fiala e mescolare energicamente. Incubare la miscela per altri 20 minuti a 42 ° C. Agglomerare le cellule a 700 xg per 5 minuti, scartare il surnatante, e risospendere ogni pellet in 3 mL di 2x YPAD. Pool tutte le cellule (per un totale di 36 mL da 12 fiale) in un matraccio da 100 mL shaker e incubare il lievito per 90 min a 30 ° C e 120 rpm. Agglomerare le cellule per 5 minuti a 700 xg ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in 4,5 mL di soluzione sterile 0,9% (w / v) di NaCl e mescolare bene accuratamente pipettando su e giù con una pipetta sierologica 10 mL. Prelevare 50 ml e preparare diluizioni di dieci volte in NaCl allo 0,9% da 1:10 fino a 1: 1.000. Piatto 100 ml di ogni diluizione su piastre di Petri di 90 mm contenenti SD-TRP-leu agar. Stendere il resto della risospensione di lievito diluito in 16 x 150 mm di diametro piatti di Petri con SD-TRP-Leu-la-ade agar. Aggiungere 3-AT al mezzo per ridurre auto-attivazione. Incubare la SD-TRP-leupiastre per tre giorni e piatti della SD-TRP-Leu-suoi-Ade per quattro giorni a 30 ° C. NOTA: I cloni che compaiono sulle piastre selettive sono (potenziali) coppie che interagiscono e portano la codifica plasmide PGAD-HA per l'esca interagire partner. Determinare l'efficienza di trasfezione contando le colonie delle diverse diluizioni seriali sulle piastre di selezione SD-TRP-Leu. Trasferire ogni clone con la scelta e striature la colonia con una punta pipetta sterile su piastre fresche SD-TRP-Leu-la-ade-selettivo. Incubare le piastre per 24 ore a 30 ° C. Ripetere questa operazione ogni giorno fino a raggiungere un totale di cinque passaggi. 8. Analisi dei cloni dalle piastre selettivi Preparare una sterile tubo di reazione da 2 ml con 1 ml di SD-TRP-Leu-la-Ade per ogni clone sotto una cappa sterile. Effettuare un foro in ogni provetta con un ago caldo e coprire il foro con un pezzo di isolante permeabile ai gas. Seminare ciascun flacone con compagno di colonia fresca rial da un clone (passo 7,17; utilizzare cloni dopo il 5 ° passaggio) e incubare per 24 ore a 30 ° C, agitando a 150 rpm. NOTA: È importante prendere cloni da una piastra fresca, perché lievito preso dalle lastre memorizzati per diversi giorni a 4 ° C non crescono sufficientemente entro 24 h nel mezzo liquido. Pellet il lievito per 5 minuti a 4000 xg ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet nel tampone di risospensione appropriata (dal rispettivo kit miniprep plasmide DNA) e trasferirlo ad un tubo di reazione da 2,0 mL fresco. Aggiungere 100 ml di perline di vetro lavata con acido (425- 600 micron di diametro) e mescolare energicamente per 5 min. Aggiungere il rispettivo tampone di lisi e procedere con la purificazione plasmide utilizzando un mini kit di preparazione plasmide seguendo le istruzioni del produttore. Eluire il DNA plasmide con 50 ml di acqua. Utilizzare il DNA dal punto 8.3 per una reazione di sequenziamento con la preda primer specifico-plasmide, GAL4ADseqref "> 41 5'- ACCACTACAATGGATGATG -3 '. Verificare l'interazione da parte de novo co-trasformazione 43, 44 l'esca e il vettore preda. Selezionare il lievito trasformato su piastre di selezione SD-TRP-Leu-la-Ade.