从非耕种植物病原菌利用酵母双杂交筛选Unravelling一个细菌效应中的作用

1.从被感染的苹果树收集根和叶片样品注意：病原体特异性DNA可以从根或叶进行纯化。以下部分提供了两个采样的协议。 对于DNA制备样品采集和准备从源头抓起认同“苹果扩散”特异性症状30,31和控制树在无症状感染的树木。使用干净修剪机，切割具有的直径为0.5根样品 – 1cm到约5cm的长度。从三个不同的根系远处部位切割样品，并把它们放到适当标记的塑料袋。 保持样品在用冷却热包冷箱，并在4℃在冰箱中存储它们，直到进一步处理。 注：根架构和结构方面有所不同生理状况ØF中的树。它在三个不同地点进行采样，不要采取过于薄细根是非常重要的。可将样本在4℃保存数日，但更长的贮存时间增加成型的危险。发霉样品不能用于DNA制备。 冲洗根样品与水以除去泥土。把它们在无菌培养皿中，并用无菌解剖刀除去根表皮和皮层。 清洁手术刀用干净，不起毛的纸巾擦拭，将它浸入70％（V / V）乙醇水溶液，加热消毒就在明火（如本生灯）。划伤韧皮部用手术刀，它切成小片，并且等分试样30 – 100毫克切碎韧皮部的进入无菌2.0毫升反应管中。储存在-80℃的样本数月。 样品采集和叶制剂确定被感染和无症状的控制树，S IN一步1.1.1.1描述，并挑选每棵树10毫发无伤的叶子。每一个条件树是足够了。 冲洗用水的叶子，并通过喷雾70％（体积/体积）乙醇溶液清洗的表面上。放的叶子在无菌培养皿中，并用无菌解剖刀解剖每个叶片的中脉（中央静脉）。从脉除去表皮和皮层，切脉小块，并且等分试样100mg的中脉组织进入无菌的2.0毫升反应管。立即使用的样本DNA制备或储存在-80℃下几个月。 注意：为方便起见，分装的植物材料中的100毫克部分和最终冻结它们进行存储。每个等分试样可直接用于DNA制备。称重速冻植物材料是麻烦的，因为冷冻植物材料会形成块。 2.十六烷基三甲铵（CTAB）为基础的DNA制备方法<p clasS =“jove_content”>注：DNA可以使用植物材料的任何基于列的DNA纯化方法进行纯化。在这一节中，描述了用于DNA纯化基于CTAB法。 DNA的纯化是基于别处32所述的改性的协议进行。 准备以下缓冲区： CTAB缓冲液：溶解1％w / v的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB中，M R：364.45克/摩尔），100毫羟基甲基氨基甲烷（TRIS，Mr 为 ：121.14克/毫升），1.4M的氯化钠（NaCl中，M R：58.44克在水372.24克/摩尔）和它们调整至pH 8.0：/摩尔），和20mM乙二胺四乙酸二钠盐（NaEDTA，男河 的N-十二烷基肌氨酸缓冲液：将10％w / v的N-月桂酰肌氨酸钠盐33（M R：293,38克/摩尔），100毫摩尔Tris，和20mM NaEDTA在水中并调节pH值至8.0。 三 – EDTA（TE）缓冲液：将10毫摩尔Tris和1mM NaEDTA水和autoclAVE的溶液。 乙酸铵溶液：在水溶液中，在120℃高压灭菌，并为20分钟1.2巴：准备一个的5M乙酸铵（77,0825克/摩尔的M r）的 。 混合30 – 100毫克新鲜或冷冻切碎的植物材料（步骤1.1.2.2）。用300微升的CTAB缓冲液，N-十二烷基肌氨酸缓冲液30微升，蛋白酶K 6微升（10微克/微升）和12微升2-巯基乙醇34（M R：78,13克/摩尔）。振摇在60℃下60分钟。让组合继续之前冷却至室温。 加乙酸铵溶液360μL，大力混合。让该溶液静置5分钟，然后以15,000 xg离心离心它在室温下10分钟。将上清转移到一个干净的瓶中，加入冰冷的异丙醇35的720微升。沉淀DNA在-20℃至少30分钟。 离心在15000 XG混合在4 30分钟°C和丢弃上清液。用冰冷的70％乙醇500微升洗涤沉淀，并在4℃下旋转下来以15,000 xg离心5分钟。 丢弃乙醇上清液，并立即浸在干净的纸巾小瓶以除去残留的水滴。请务必以去除尽可能多的液体越好。空气干燥沉淀15-20分钟，或在真空浓缩器离心2-3分钟。不要过度干燥过量加热或延长蒸发时间的沉淀。 重悬在TE缓冲液700微升沉淀，并最终暖机至37℃以促进溶解。添加RNA酶的10微升（10微克/微升），在37°C孵育它为15分钟，以300rpm摇动。 加入700μl氯仿：异戊醇36 24：1，拌匀。离心混合物以20,000×g离心10分钟，在4℃和上清液的上层相转移至新的，干净的小瓶中。 通过加入沉淀上清液中的DNA的700微升的2-丙醇35（异丙醇，Mr 为 60.1克/摩尔），并在-20℃温育至少30分钟。离心混合物以12,000×g离心30分钟，在4℃并丢弃上清液。 洗用70％乙醇和离心机的500微升沉淀以12,000 xg离心在4℃下5分钟。如步骤2.5中所述干燥沉淀。溶解在TE中50微升。 通过PCR检测3.植原暂定马里特异性DNA 稀释在无核酸酶水从植物材料1:10纯化DNA，并运行与病原体特异性引物37的PCR。 通过使用引物和特异性探针为P.马里植37定量PCR协议验证在植物材料P马里特异性DNA的存在。通过用钙的各探针进行同样的PCR检查缺席其他16SrX植构件ND。 P. prunorum和C和。 P.螨DNA 37。 注意：从非感染树DNA的应测试以及，确认没有在此控制的病原体。在此步骤中，重要的是从其他密切相关的植物种的DNA样品中不存在，因为这将增加从比P.马里其他一个植物种扩增的效应的风险。与其他密切相关的P.马里16SrX组植原体混合感染是通过分析与各自的探头样本排除。由于预期的结果应为负，其他16SrX植原体，它包括指示PCR疗效适当的阳性对照是非常重要的。 4.放大效应的潜在基因亚克隆到Y2H诱饵载体扩增P的phytoplasmal基因atp_00189（未包括信号肽部分）使用引物5 马里-TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA-3（正向）和5- TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT -3-（反向），以在5'和3'末端，分别限制性位点为EcoRⅠ和SalⅠ位 。净化与基于列的DNA纯化方法中的PCR产物。 克隆扩增子成通过 Eco RI和Sal结扎Y2H诱饵载体pLexA-N。 注：在这里，100纳克Eco RI和Sal的线性pLexA-N载体与类似消化atp_00189 PCR扩增子和1个单位T4连接酶15纳克相结合。在含有40毫摩尔的Tris-HCl（pH为7.9，在25℃）缓冲液中进行连接反应，10毫的MgCl 2，10毫二硫苏糖醇（DTT中，M R：154.25克/摩尔），和0.5mM三磷酸腺苷（ATP，男△：在10.0微升在16℃过夜（14-20八）总体积507.18克/摩尔）。从分析使用相同的引物的未感染的树中的DNA，以排除非特异性引物结合到苹果点¯x家蝇</ em>的DNA。 变换连接混合物到大肠杆菌电感受态细胞的1微升，并选择在Luria-BERTANI卡那霉素抗性克隆（LB）平板补充有50微克/毫升卡那霉素硫酸盐38。 净化从以下制造商的说明基于列的质粒微型制备试剂盒的选定的细菌克隆的质粒DNA，并通过测序39检查插入的成功整合和方向。 5.测试潜在效应蛋白的自我激活（自动激活） 准备下列缓冲和生长介质： 注：对于酵母选择性平板叫法的命名法在各自的培养基中的缺失的氨基酸与缩写一个“ – ”之前的缩写。例如，SD-TRP-LEU-他的板包含所有氨基酸，但色氨酸，亮氨酸和他。 10X辍学混合：称取200毫克L-精氨酸盐酸盐（M R：210.66克/摩尔），300毫克L-异亮氨酸（M R：131.17克/摩尔），269毫克的L-赖氨酸一水合物（M R：164.21克/摩尔）， 200毫克L-蛋氨酸（M R：149.21克/摩尔），500毫克L-苯丙氨酸（M R：165.19克/摩尔），2克L-苏氨酸（M R：119.12克/摩尔），300毫克L-酪氨酸（先生：181.19克/摩尔），200毫克的L-尿嘧啶（112.09克/摩尔）和1.5克L-缬氨酸（M R：117.15克/摩尔）。将它们溶解在1升的双蒸水和高压灭菌的溶液中。保持在4℃的溶液中。 注：各辍学拌匀即可还购买预混。 10倍的L-腺嘌呤补充：称取100毫克的L-腺嘌呤半硫酸盐（ADE中，M R：184.17克/摩尔）和在50ml的双蒸水溶解。过滤消毒用0.22μm的微孔过滤的溶液。 10X L-组氨酸补充：称取100毫克L-组氨酸盐酸盐一水合物（他的，Mr 为 </suB>：209.63克/摩尔）在50毫升双蒸水和过滤用0.22微米的微孔过滤消毒它。 10倍的L-亮氨酸补充：在50ml的双蒸水和过滤用0.22微米的微孔过滤消毒它：称取500毫克的L-亮氨酸（113.17克/摩尔亮氨酸，男r）的的。 10倍的L-色氨酸补充：在50ml的双蒸水和过滤用0.22微米的微孔过滤消毒它：称取100毫克的L-色氨酸（204.23克/摩尔trp启动中，M R）的。 SD-TRP-LEU-他-ADE-介质和板材：将0.67％w / v的酵母氮碱（无氨基酸）和2％w / v的D-葡萄糖一水合物（M R：198.17克/摩尔）的双蒸馏水和高压釜中。对琼脂平板，加2％w / v的琼脂（微生物级）之前高压灭菌。 为了准备选择性平板，添加氨基酸原液的1倍至蒸压自Süd-TRP-列伊 – 他 – 埃德网上平台。当准备盘子，确保琼脂是增加前冷却到〜50°C的氨基酸。保持储备溶液无菌。 YPAD培养基：溶解1％w / v的酵母提取物，2％w / v的蛋白胨（微生物级），0.004％w / v的腺嘌呤半硫酸盐（M R：184.17克/摩尔），和2％w / v的葡萄糖一水合物双蒸水和高压釜中。为YPAD琼脂平板，w / v的琼脂高压灭菌之前添加2％。为了准备2个YPAD，使用上面提到的成分的两倍浓度。 注：（可选）由于在中高浓度的葡萄糖，2个YPAD中变成高压灭菌后黑褐色。作为一种替代，一个40％（重量/体积）葡萄糖储液可制备并使其通过一个0.22微米的过滤器进行灭菌。然后将过滤灭菌的葡萄糖原液在无菌条件下加入到高压灭菌2×YPAD（缺乏葡萄糖）。为了避免卷错误，2倍YPAD必须做好准备，牢记10倍的葡萄糖溶液随后加入。这意味着，例如，代替1升Ò的F培养基中，只有900毫升制备（含有除葡萄糖的所有成分）并高压灭菌，然后加入100毫升的葡萄糖储液。 用于测试自激活醋酸锂介导的酵母转化 Streak的酿酒酵母报告菌株NMY51 40（NMY51：MATahis3Δ200trp1-901 leu2-3,112 ADE2 LYS2：:( lexAop）4 HIS3 URA3：:( lexAop）8 lacZ的ADE2：:( lexAop）8 ADE2 GAL4）从上的YPAD琼脂平板冷冻甘油库存，并在30°C孵育它48小时。接此片菌落接​​种50毫升YPAD培养基。让酵母生长和定期测量的OD 600来监控生长。 让酵母生长至最终OD 0.5-0.8 600。通过在700 xg离心离心他们5分钟沉淀细胞，并在2.5毫升双蒸，高压灭菌水重悬。 准备六节等分用100微升酵母悬浮并加入50微升240％w / v的聚乙二醇4000（PEG中，M R：3,500-4,000克/摩尔），36微升的1M醋酸锂二水合物（LiOAc中，M R：102.02克/摩尔），和2％的25微升w / v的鲑鱼精子DNA（溶解的）。准备所有试剂用双蒸无菌水。 标签从“A”到“F”含有酵母悬浮六瓶，并添加以下质粒载体DNA：阴性对照：（1）1.5与效应（pLexA-N-atp00189 28）诱饵质粒微克，（B） 1.5微克空猎物质粒pGAD-HA 41，（C）1.5微克空诱饵载体pLexA-N 41，和（d）的空诱饵载体pLexA-N 1.5微克和空猎物质粒pGAD-HA 1.5微克;阳性对照：（E）的阳性对照诱饵质粒pLexA-P53 41和1.5微克正猎物质粒的pACT-largeT 41为1.5μg;和自活化试验：（F）BA 1.5微克它与效应（pLexA-N-atp00189）和1.5微克空猎物质粒pGAD-HA的质粒。 混合反应剧烈并在水浴中在42℃孵育他们45分钟。沉淀细胞在700 xg离心5分钟并弃上清。将细胞重悬于250微升0.9％（重量/体积）的氯化钠溶液（氯化钠中，M R：48.44克/摩尔）和铺在下面的选择性平板50微升：SD-trp启动，SD-亮氨酸，SD-trp-列伊，SD-TRP-LEU-他和SD-TRP-列伊 – 他 – 埃德。 孵育3板 – 第4天，30℃。培养后的第一天，密封件用塑料石蜡膜板，以防止所述板干燥。 检查板上的酵母生长。 6.测试效应的表达测试通过Western印迹42的效应的表达与抗被耦合在所述效应器时的N-末端的莱克斯-A标记的抗体从pLexA-N表示。 注：认为翻译融合的Lex-A标签增加了约24 kDa的感兴趣的蛋白质的实际重量。识别所述Western印迹的蛋白质尺寸时，这是很重要的。 7. Y2H屏幕条纹的pLexA-atp00189（效应） – 转化NMY51在新鲜的SD-trp启动板，让它生长2 – 1天在30℃，直至红色菌落出现。 接种3毫升的SD-trp启动介质的与来自琼脂板红色菌落的小摇瓶中，并在30℃下以120振摇孵育过夜 – 150转。 接种20毫升SD-TRP在1毫升过夜培养的摇瓶，让它生长8小时。 调整培养通过添加SD-trp启动平台向OD 600 = 0.2，并在用10毫升的每个起始培养的摇瓶接种2×100毫升。在30℃振荡生长过夜。 注：确保酵母不会达到OD 600> 0.5，并用新鲜的SD-trp启动稀。 测量OD 600和粒料120 OD 600“单位”。例如，如果600的1.2的OD测量，降速100毫升，弃上清，重悬在800毫升预热2×YPAD的粒料在用磁力搅拌棒的摇瓶中。 降速2毫升等分试样，除去上清液，重悬沉淀于水中。确保酵母悬浮液的OD 600为0.15和0.2之间。如果不是，调整2倍YPAD或过夜培养添加更多的酵母。 注：2倍YPAD是深褐色，可以影响OD测量结果。因此，有必要确定OD之前悬浮在水中的酵母细胞。作为替代，2×YPAD可以通过单独灭菌的葡萄糖来制备，如在步骤5.1.8音符，从而防止介质的暗着色说明。 孵育剩余的酵母培养物中的应用ropriately尺寸摇瓶（800毫升中的2L摇瓶或除以2×400毫升成两个1升摇瓶）中，在30℃，120孵育 – 150转。测量外径600大约每1.5小时，直到OD达到0.6 600（需要4 – 6小时）。在此同时，准备在下一步骤中描述的解决方案。 醋酸锂介导的转化溶解2％w / v的鲑鱼精子DNA在水中，在100℃的水浴中煮沸500微升5分钟。放置在冰上的管2分钟，然后重复加热步骤。置于冰上的DNA备用。 准备下列混合物： TE / LiOAC混合：混合3.08毫升的1M LiOAC的，3.08毫升的100mM的Tris / 10mM EDTA的（pH值：7.5），和21.84毫升无菌双蒸水。 PEG / LiOAc混合：联合4.2毫升的1摩尔LiOAc的，4.2毫升毫米的Tris的/ 10毫EDTA（pH值：7.5），和33.6毫升的50％（重量/体积）的PEG 4000。 离心机800毫升酵母培养物（OD 600 = 0.6）在700×g离心5分钟以沉淀细胞。除去上清液和重悬沉淀在200毫升的无菌双蒸水。再次沉淀细胞，在700×g离心5分钟并弃上清。注意：如果需要分暂停分成几个小瓶离心。液体卷7.7.3。 7.7.4和。指的是从800毫升悬浮液中产生的整个颗粒。 重悬在16毫升TE / LiOAc混合颗粒（见步骤7.7.1.1）;降速在700×g离心5分钟并弃上清。重悬9.6毫升TE / LiOAC混合沉淀。 准备下列反应混入适当大小的反应聚丙烯容器：12小瓶pGAD-HA-cDNA文库载体7微克，100微升2％鲑鱼精子DNA（见步骤7.7），和2.5毫升PEG / LiOAc组合。从步骤7.10到每个12小瓶添加酵母细胞悬浮液的600微升和1分钟剧烈混合。 孵育45分钟，反应混合物在30℃的水浴中一ð剧烈混合，每15分钟。加入DMSO 160μL每小瓶大力混合。孵育另外20分钟，混合，在42℃。 沉淀细胞，在700×g离心5分钟，弃去上清液，并在3毫升2×YPAD的悬浮每个粒料。池在100毫升摇瓶中的所有细胞（从12小瓶总共36毫升），并孵育酵母在30℃下90分钟和120转。 沉淀细胞在700 xg离心5分钟并弃上清。重悬沉淀4.5毫升无菌的0.9％（重量/体积）NaCl和通过仔细上下吹打用10毫升血清吸管拌匀。撤销50微升，并准备在0.9％氯化钠十倍稀释1:10到1：1000。板100μL含SD-TRP-列伊琼脂90毫米培养皿中每个稀释度。 传播与SD-TRP-列伊 – 他 – 埃德琼脂16×150毫米直径的培养皿未稀释的酵母悬浮的其余部分。添加3-AT向培养基中，以减少自激活。孵育SD-TRP-列伊三天板与SD-TRP-LEU-他-阿德板四天在30℃。 注：出现在选择平板克隆（潜在）相互作用对，开展为诱饵进行交互合作伙伴pGAD-HA质粒编码。 通过在SD-TRP-亮氨酸选择平板计数不同系列稀释的菌落确定转染效率。通过挑选和新鲜SD-TRP-LEU-他-ADE-选择平板无菌的枪头裸奔殖民地转移每个克隆。孵育24小时将板在30℃。直至达到总共五个通道每天重复此步骤。 8.从选择性平板分析克隆人准备一台无菌2毫升的反应用1毫升SD-TRP-列伊 – 他 – 埃德每个克隆的管无菌罩下。冲一个孔进入每个管与热针和盖用一块气体可渗透密封剂的孔。接种新鲜菌落队友每一瓶里亚尔从一个克隆（步骤7.17;使用的第 5 次传代后的克隆），并在30°C孵育24小时，以150rpm摇动。 注意：这是从一个新鲜板取克隆重要的，因为在4℃下从存储数天板采取酵母不允许液体培养基在24小时内充分生长。 沉淀5分钟的酵母在4000 xg离心并弃去上清液。重悬在合适的重悬浮缓冲液的粒料（来自各质粒DNA小量制备试剂盒），并转移到一个新的2.0毫升反应管。加入100微升的酸洗的玻璃珠（425- 600微米直径）和5分钟剧烈混合。 添加相应的裂解缓冲液并使用按照制造商的指示质粒制备mini试剂盒的质粒纯化进行。洗脱用的水50微升质粒DNA。 从步骤8.3使用该DNA用于与捕食特定质粒引物，GAL4ADseq测序反应REF“> 41 5'- ACCACTACAATGGATGATG -3”。 验证由所述相互作用从头共转化43,44诱饵和猎物载体。选择SD-TRP-列伊 – 他 – 埃德选择板转化的酵母。