Diferenciación in vitro de las fibras maduras de imágenes en vivo

NOTA: uno se rinde ratón mioblastos suficientes para aproximadamente dos placas de 35 mm o dos platos de generación de imágenes en vivo, por lo mattings plan, la disección, y recubrimiento (paso 2.6) en consecuencia. Desde mioblastos se aíslan mediante centrifugaciones secuenciales y preplating, el protocolo debe hacerse en lotes de 5 – 10 animales. Todos los procedimientos que involucran sujetos animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Instituto de Medicina Molecular y la Universidad Pierre et Marie Curie 1. La disección de los ratones recién nacidos Los músculos de las extremidades posteriores Preparar todas las soluciones de antemano (Tabla de Materiales) y esterilizar por filtración (0,22 micras filtro). Asegúrese de que todos los medios de comunicación son a 37 ° C antes de la adición a las células, con excepción de las formulaciones que contienen la matriz de la membrana basal (por ejemplo, Matrigel). Esterilizar el material de disección (uno por cada uno de: tijeras curvas rectas, tijeras, pinzas regulares,y unas pinzas de punta fina) y el banco de trabajo, limpiándolos con un 70% de etanol. Preparar un plato de 100 mm de Petri con 5 ml de Dulbecco tamponada con fosfato salino (DPBS) para la recogida de los músculos y mantener en hielo hasta que el paso de picar carne. Decapitar a P6 – P8 ratones con tijeras rectas y esterilizar la piel con etanol al 70%. Hacer una incisión en la piel de la espalda y tire de ella suavemente hacia las extremidades posteriores hasta que se retira, dejando al descubierto por completo la musculatura de las extremidades posteriores. Utilice las pinzas para quitar el tejido graso sin dañar los músculos. Para eliminar los músculos de las extremidades posteriores dorsales, mantener la extremidad estirado y doblar la pata para exponer los tendones del talón. Usar las tijeras curvadas para músculo separado del hueso, a partir de los tendones, deslizando y de corte hacia arriba con suavidad. Extirpar los músculos y colocarlos en DPBS helado. Aislar el cuádriceps pellizcando el músculo con unas pinzas de punta fina y cortar alrededor de ella sin dañar el fémur o la articulación de la rodilla. Después de la disección de todos los animales, proceder a una campana de cultivo de células de flujo laminar estéril, donde se deben realizar todos los pasos siguientes. 2. Aislamiento de mioblastos Retire el exceso de DPBS. Picar el tejido con tijeras curvas esterilizados a fin de obtener una masa uniforme. Recoger el tejido picado en un tubo de centrífuga de 50 ml cónico utilizando 5 ml de la mezcla de digestión y se incuba con agitación a 37 ° C durante 90 min. Detener la digestión mediante la adición de 6 ml de medio de disección y se centrifuga la suspensión durante 5 min a 75 xg para sedimentar el tejido restante. Recoger cuidadosamente el sobrenadante. Asegúrese de no recoger los desechos de los tejidos. Centrifugar al 350 xg durante 5 min; volver a suspender en 5 ml de medio de disección. Se filtra la suspensión celular a través de un filtro de células de 40 micras. Añadir 25 ml de medio de disección y la presiembra en un plato 150 mm durante 4 h en un incubador de cultivo de células (37 ° C y 5% de CO 2 </ Sub>) para permitir que los fibroblastos se adhieren. Mientras preplating, platos capa con 500 l de matriz de membrana basal diluyeron 1: 100 en IMDM frío durante 1 h a TA. Lavar una vez con DPBS y la placa de las células inmediatamente (paso 2.8) o salir con medio de crecimiento hasta el chapado. Después de preplating, recoger el sobrenadante y centrifugar al 350 xg durante 10 min. Volver a suspender en medio de crecimiento y contar las células en un hemocitómetro. Ajustar el volumen para que entre 150.000 y 250.000 células se colocan por membrana basal plato de matriz-revestido. Mantener las células en una incubadora de cultivo celular. 3. Diferenciación miofibrilar NOTA: Después de 3 d, las células deben comenzar a fundirse y formar miotubos en torno al 70% de confluencia (Figura 1B). En este punto, transfectar las células, si se desea, con un siRNA o ADN de interés. Si no se pueden transfectar a las células, cambiar directamente al medio de diferenciación y de esquíp al paso 3.4. Transfectar con reactivos de transfección siguientes instrucciones del fabricante. Se incuban las células durante 5 h con complejos siRNA-lípido (20 nM + 1 l de reactivo) o complejos de ADN-lípido (1 g + 1 l de reactivo). Optimizar las concentraciones de siRNA y de ADN, si es necesario. Lavarlos una vez con medio de diferenciación y luego cambiar a un nuevo medio de diferenciación. El día siguiente, se diluye la matriz de la membrana basal 1: 2 en medio de diferenciación enfriado con hielo. Retire el medio existente y añadir 200 l de matriz helada para cada plato. Incubar durante 30 min en un incubador de cultivo celular. Suplemento el medio de diferenciación con la agrina (100 ng / ml) y añadir con cuidado 2 ml a las células. cambiar cuidadosamente la mitad del medio cada 2 d, siempre que complementa con la agrina a una concentración final de 100 ng / l. Monitor de la diferenciación celular y la viabilidad. Dependiendo de una variedad de factores (tales como FBS y chicken orígenes extracto de embrión), las células podría tomar entre de 5 – 10 d diferenciación para llegar a la maduración completa (Figura 2). 4. La inmunotinción en platos con fondo de cristal Para la inmunotinción, en cualquier momento, lugar de interés, se lavan las células una vez con DPBS y fijarlas con PFA al 4% a temperatura ambiente durante 10 min. Lavar dos veces con DPBS. En este punto, las células se pueden almacenar a 4 ° C. Permeabilizar con 0,5% Triton X-100 durante 5 min a RT. Lavar dos veces con PBS y bloquear con solución de bloqueo durante 30 min a RT. Incubar con el anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo O / N a 4 ° C. Lavar 3 veces con DPBS durante 5 min a RT. Incubar con el anticuerpo secundario y 0,2 g / ml de DAPI durante 1 h a TA. Lavar 3 veces con DPBS durante 5 min a RT. Añadir 200 l de medio de montaje y proceder a la formación de imágenes.