Summary

Un semplice passo-dissezione Protocollo per tutto il montaggio Preparazione per adulti<em> Drosophila</em> Brains

Published: December 01, 2016
doi:

Summary

L'adulto Drosophila cervello è un sistema utile per studiare circuiti neuronali, le funzioni cerebrali superiori, e malattie complesse. Un metodo efficace per sezionare intero tessuto cerebrale dalla testa piccola mosca faciliterà gli studi del cervello-based. Qui si descrive un semplice, one-step protocollo dissezione del cervello adulto con ben conservato morfologia.

Abstract

Vi è un crescente interesse nell'uso di Drosophila per modellare cervello malattie degenerative umane, la mappa circuiterie neuronali nel cervello adulto, e studiare le basi molecolari e cellulari delle funzioni cerebrali superiori. Una preparazione tutto il montaggio del cervello adulto con ben conservato la morfologia è fondamentale per tali studi intero cervello-based, ma può essere tecnicamente impegnativo e richiede molto tempo. Questo protocollo descrive un approccio dissezione one-step facile da imparare, di una testa adulta mosca in meno di 10 s, mantenendo il cervello intatto attaccato al resto del corpo per facilitare le successive fasi di lavorazione. La procedura aiuta a rimuovere la maggior parte dei tessuti oculari e tracheali normalmente associati con il cervello che può interferire con la fase di imaging più tardi, e pone anche meno domanda sulla qualità delle dissettore. Inoltre, si descrive un metodo semplice che consente comoda capovolgimento dei campioni cerebrali montati su un vetrino, che è importante per l'imaging entrambi i lati della bpiogge con intensità di segnale simile e qualità. Come esempio di protocollo, presentiamo un'analisi dopaminergici (DA) neuroni nel cervello adulto di WT (w 1118) mosche. L'elevata efficacia del metodo di dissezione lo rende particolarmente utile per gli studi basati su cervello adulto su larga scala in Drosophila.

Introduction

L'organismo modello Drosophila, comunemente nota come la mosca della frutta, è stato a lungo apprezzato per i suoi eleganti strumenti genetici, tempi brevi riproduttivi, e altamente conservata percorsi molecolari e cellulari. Il moscerino della frutta è stato impiegato con successo per analizzare i percorsi di base di segnalazione, i meccanismi patterning di organismi multicellulari, nonché i meccanismi alla base dello sviluppo neuronale, le funzioni e le malattie 1,2. Con i recenti progressi nelle tecnologie di etichettatura delle cellule e di imaging, il cervello mosca della frutta è diventato particolarmente potente nella mappatura fine di circuiti neuronali e nella dissezione delle basi molecolari e cellulari delle funzioni cerebrali superiori, come l'apprendimento e la memoria, e il ritmo circadiano 1,3, 4,5,6,7,8.

Un particolare vantaggio del sistema Drosophila è la sua dimensione relativamente piccola, permettendo tutto il montaggio la preparazione e l'esame del cervello utilizzando un composto regolare o microscopio confocale. ThiFunzione s consente analisi dettagliate anatomiche e funzionali di circuiti neuronali, o anche un singolo neurone, a livello cellulare e subcellulare, nel contesto di un tessuto cerebrale intera, fornendo quindi sia una visione olistica del soggetto studiato e la sua geometria precisa all'interno dell'intero cervello. Tuttavia, date le dimensioni piuttosto miniatura del cervello, presenta anche una sfida tecnica in sezionare in modo efficiente un tessuto cerebrale intatto fuori dalla custodia protettiva testa esoscheletro in una mosca adulta. Vari metodi dissezione efficaci e relativamente semplici sono state descritte in dettaglio, che di solito comporta un'attenta e graduale rimozione del caso testa ei relativi tessuti compresi gli occhi, trachea, e grasso dal cervello corretta 9, 10. Questi metodi di dissezione microchirurgia pone spesso domande piuttosto stringenti sulla qualità delle pinze dissezione, basandosi su una pinza con punte sottili ben allineati che possono essere facilmente danneggiati. Inoltre, come i cervelli sezionati sono spesso separatcato dal resto del corpo, i cervelli possono essere facilmente perse durante i successivi processi di colorazione e lavaggio a causa delle loro piccole dimensioni e la loro trasparenza nel buffer di elaborazione. Qui, descriviamo un relativamente semplice e facile da imparare, protocollo di dissezione one-step per cervello adulto che mantiene il cervello sezionati attaccati al torso. Il processo di dissezione spesso cancella facilmente via la maggior parte dei tessuti cerebrali associate come l'occhio e la trachea e riduce la domanda di pinze dissezione di buona qualità.

Inoltre, quando l'imaging del cervello al microscopio composto fluorescente o microscopio confocale, la parte del cervello che è lontano dalla sorgente di luce fluorescente spesso produce un segnale più debole e immagini meno chiare a causa dello spessore del cervello intero montaggio. Qui, descriviamo anche un semplice metodo di montaggio che consente una facile capovolgimento dei campioni cerebrali, consentendo comoda immagini di entrambi i lati del cervello con simili intensi segnalety e qualità.

Come un proof-of-concept per l'applicazione di questo metodo per studiare il cervello adulto, abbiamo esaminato ulteriormente la presenza di neuroni DA nel cervello di w 1118 mosche; un genotipo che viene spesso utilizzato come la linea dei genitori per la generazione di mosche transgeniche e il controllo di tipo selvatico in molti studi di Drosophila.

Protocol

1. Le soluzioni usate per Brain dissezione e colorazione di immunofluorescenza Sezionare l'adulto volare cervelli in artificiale liquido cerebro-spinale (aCSF): 119 mm NaCl, 26,2 mM NaHCO 3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 1,3 mm MgCl 2, e 10 mm di glucosio. Prima dell'uso, gas ACSF con il 5% di CO 2/95% O 2 per 10 – 15 minuti e picco con 2,5 mM CaCl 2. Sterilizzare la soluzione aCSF filtrando attraverso un filtro di 0,22 micron…

Representative Results

La Figura 1 illustra le procedure principali per dissezione cervello adulto, come sopra descritto le figure 2 e 3 sono immagini rappresentative di 3 giorni di età WT. (Genotipo: w 1118) adulto vola cervello, che sono stati costained con un anticorpo contro la tirosina idrossilasi (TH , colorato in rosso nella figura 2 e nero in figura 3), un marker comunemente usato per etichettare n…

Discussion

Con un crescente interesse ad utilizzare per adulti Drosophila cervello per studiare malattie umane del cervello, circuiti neuronali, e le funzioni cerebrali superiori, è necessario sviluppare metodi semplici e veloci per ottenere il cervello della mosca intatto per tutto il montaggio analisi, che è particolarmente importante per larga scalare schermi cervello-based. Il nostro metodo fornisce una semplice e facile da imparare approccio per sezionare una testa di mosca (spesso in meno di 10 s con esperienza) c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Riconosciamo Mr. Enes Mehmet, la signora Kiara Andrade, la signora Pilar Rodriguez, Chris Kwok, e la signora Danna Ghafir per il loro immenso sostegno al progetto.

Materials

w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 Bloomington Drosophila Stock Center 51652 Balancer was switched to TM6B
PBac{WH}parkf01950 Exelixis at Harvard Medical School f01950 Balancer was switched to TM6C
NaCl Fisher Scientific S640-500
Sodium Bicarbonate (NaHCO3 Fisher Scientific 02-003-990
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-500
Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) Fisher Scientific 02-004-198
Magnesium Chloride (MgCl2) Fisher Scientific 02-003-265
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876-500G Replaces glucose
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G
EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size Fisher Scientific GVWP14250
Formalin Solution, 10% (Histological) Fisher Scientific SF98-20
Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent Fisher Scientific 02-003-823
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points Fisher Scientific 17-456-055 Protocol does not require very fine points. 
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody Pel-Freez Biologicals P40101
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav The Developmental Studies Hybridoma Bank Clone 7E8A10
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate ThermoFisher Scientific A-21247
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific A-11037
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher Scientific 62248
Propyl gallate powder Sigma-Aldrich P3130-100G
Glycerol ACS reagent, ≥99.5% Sigma-Aldrich G7893-500ML
Zeiss Axioimager Z1 Zeiss Quote
Zeiss Apotome.2 Zeiss Quote
Zen lite software Quote

References

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Cite This Article
Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J. Vis. Exp. (118), e55128, doi:10.3791/55128 (2016).

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