ניטור אסטרוציט תגובתיות התפשטות במבחנה בתנאים כמו איסכמי
Summary
שבץ איסכמי הוא אירוע מורכב שבו התרומה ספציפי של האסטרוציטים לאזור במוח המושפעים נחשפים גלוקוז חוסר חמצן (OGD) הוא קשה ללמוד. מאמר זה מציג מתודולוגיה להשיג האסטרוציטים מבודד וללמוד שלהם תגובתיות והתפשטות בתנאים OGD.
Abstract
שבץ איסכמי הוא פגיעה מוחית מורכבת הנגרמת על ידי כגון או תסחיף חוסם את זרימת הדם אל חלקים במוח. זה מוביל לקיפוח של חמצן, גלוקוז, אשר גורם אנרגיה ולמוות עצביים. לאחר עלבון שבץ איסכמי, האסטרוציטים הפך תגובתי, להתרבות סביב האתר פציעה כפי שהוא מתפתח. בתסריט הזה, קשה ללמוד את התרומה ספציפי של האסטרוציטים לאזור המוח חשוף איסכמיה. לכן, מאמר זה מציג מתודולוגיה ללמוד אסטרוציט העיקרי תגובתיות והתפשטות תחת מודל במבחנה של סביבה, כמו איסכמיה, שנקרא גלוקוז חוסר חמצן (OGD). האסטרוציטים הם בודדו אותנו מהמתרחש 1-4 ימים-חולדות neonatal הישן, מספר התאים astrocytic שאינם ספציפיים הוערכה באמצעות סמן סלקטיבי אסטרוציט גליה Fibrillary חומצי חלבון (GFAP) וצביעת גרעינית. התקופה שבה האסטרוציטים נחשפים לתנאי OGD יכול להיות מותאם אישית, כמו גם אחוז החמצן שהם נחשפים. גמישות זו מאפשרת למדענים לאפיין את משך התנאי איסכמי כמו בקבוצות שונות של תאים בתוך חוץ גופית. מאמר זה מתאר את מסגרת זמן של OGD זה לגרום אסטרוציט תגובתיות מורפולוגיה היפרטרופית, התפשטות כפי שהיא נמדדת immunofluorescence באמצעות מתרבים תאים גרעיניים אנטיגן (PCNA). מלבד התפשטות, האסטרוציטים עוברים אנרגיה סטרס חמצוני, להגיב OGD על ידי שחרור גורמים מסיסים לתוך התא האמצעי. בינוני יכול להיות ונשתמש בהם כדי לנתח את ההשפעות של מולקולות שפורסמו על ידי האסטרוציטים בתרבויות עצביים ראשי ללא אינטראקציה עם מתא לתא. לסיכום, המודל התרבות התא הראשי ניתן להשתמש ביעילות כדי להבין את התפקיד של האסטרוציטים מבודד על פגיעה.
Introduction
קו מוגדר כ- “חריפה נוירולוגיות בתפקוד כלי דם המקור עם התפתחות מהירה או פתאומית של תסמינים וסימנים, התואם מעורבותם של תחומי פעילות במוח”1,2. ישנם שני סוגים של שבץ: hemorrhagic, איסכמי. כאשר תפקוד כלי הדם נגרמת על-ידי מפרצת או תקלה עורקית, מלווה בהיחלשות עם קרע אחורי של עורק, זה נקרא שבץ מדמם3 אשר, ברוב המקרים, מובילה למוות. כאשר כגון או תסחיף מונעת זרימת הדם, גורם זמני מניעת חמצן, גלוקוז לאזור במוח, זה נקרא שבץ איסכמי4. כשל לטפח תאים סביב האזור הנגוע או מוביל איסכמי הליבה איזון homeostatic וחילוף, תפקוד אנרגטי, מוות עצביים ו דלקת5, אשר יכול לגרום נכות לכל החיים עבור חולים6.
שבץ איסכמי הוא פגיעה multifactorial המערבים מספר סוגים של תאים להגיב ולהפעיל את ההשפעות שלהם בנקודות זמן שונות. אינטראקציות רבות ליצור סביבה קשה ללמוד את אופן הפעולה של תאים בודדים. ? אז, איך לומדים את התרומה של סוג תא מסוים תחת סביבה מורכבת? מודל מקובל במבחנה של איסכמיה מורכב של חשיפת תאים כדי מניעת חמצן, גלוקוז (OGD), במשך תקופה מסוימת, ואחריו את השחזור של תאים normoxic לסביבה. מערכת זו מדמה של שבץ איסכמי ואחריו פגיעה reperfusion דם. בשיטה זו, תאים או רקמות נחשפים בתקשורת ללא גלוקוז בסביבה ללא חמצן, באמצעות תא ובשפתיים מיוחדים. זמן הדגירה OGD יכול להשתנות בין מספר דקות עד 24 h, בהתאם ההיפותזה רוצה להיבדק. מחקרים הראו כי בהתאם הזמנים של OGD, normoxic הסביבה, פנוטיפים ספציפי של שבץ (קרי, חריפה או subchronic) יכולה להיות מושגת. ראשי האסטרוציטים מבודד, נחשפים OGD עם שיקום האחורי לתנאים normoxic, הוא מודל הסלולר למד היטב כדי לחקות קו במבחנה7. שימוש OGD אפשרי לחשוף את המנגנונים המולקולריים עצמאית של תאים בודד תחת סביבה דמויי שבץ.
הידע שלנו על ביולוגיה אסטרוציט גודלת, זה הפך ברור כי הם חיוניים עבור שמירה על הסינפסות ומנחם תיקון, ופיתוח פלסטיות עצבית8. בתנאים רגילים, האסטרוציטים לשחרר ולהגיב ציטוקינים, נוגדנים, גורמי גדילה, gliotransmitters, שמירה על איזון מטבולי, הומאוסטזיס בתוך הסינפסות5,9. ב- neuroinflammation חריפה, כגון שבץ איסכמי, תאים אלה יכולים להפוך תגובתי, להראות ביטוי ארוכות טווח של גליה Fibrillary חומצי חלבון (GFAP) ולהציג היפרטרופיה שלהם מורפולוגיה5,10, 11 , 12. כמו אירוע איסכמי מתפתח, הומאוסטזיס שסופקו על-ידי האסטרוציטים הופך להיות מושפעת, לגבי ספיגת גלוטמט נורמלי, חילוף החומרים האנרגיה, חילופי מולקולות פעילים, נוגד חמצון פעילות13.
האסטרוציטים שהופעלה מחדש להתרבות סביב הרקמה לאוטם בזמן לויקוציטים נודדים לכיוון אזור lesioned14. תפוצת astrocytic ניתן למדוד באמצעות סמנים כגון מתרבים תאים גרעיניים אנטיגן (PCNA), Ki67 ו- bromodeoxyuridine (BrdU)15. תגובה proliferative זו נוצרת באופן תלוי-זמן והיא מסייעת ויוצרים את הצלקת גליה, מערך האסטרוציטים בלתי הפיך תגובתי לאורך parenchyma של אתר פגום אחרי הפציעה9. אחת מהפונקציות הראשונית של הצלקת הזאת היא להגביל את extravasation תא החיסון מהאזור הזה. עם זאת, מחקרים הראו כי הצלקת הופך ליקוי פיזי עבור אקסונים להרחיב, כפי הם משחררים מולקולות מעכבות את הצמיחה עצב, וליצור מכשול פיסי מניעת אקסונים הארכת סביב האזור הפגוע ה-16. עם זאת, יש ראיות מדעיות מראה כי לאחר פציעה בחוט השדרה, לגמרי מניעת היווצרות צלקת גליה עלול לפגום לרגנרציה של אקסונים17. לפיכך, ההקשר שבו נמדד התגובה astrocytic ספציפי, יש לקחת בחשבון על המסגרת של הפגיעה למד.
המתודולוגיה שהוצגו יכול להיות מיושם בו הפונקציה תגובותיהם של האסטרוציטים לאחר חוסר חמצן גלוקוזה, שניתן יהיה לשנותה בהתאם השאלות החוקר רוצה לענות. לדוגמה, מלבד שינוי מורפולוגי, את סמני הביע בזמנים שונים, OGD, supernatants מן האסטרוציטים נחשפים OGD ניתן עוד לנתח כדי לזהות גורמים מסיסים שפורסמו על ידי תאים אלה, או משתמשת באמצעי התקשורת ממוזגים להעריך שלה אפקט בתאים אחרים במוח. גישה זו מאפשרת מחקרים על תגובתיות אסטרוציט העלולה להוביל הבהרה של הגורמים ותקנות לווסת את תגובתם בתרחיש של שבץ איסכמי.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את ניתוקה של האסטרוציטים מן החולדה cortices. בשיטה זו, חיוני כדי להקטין זיהום עם סוגי הסלולר אחרים כגון מיקרוגלייה, oligodendrocytes להפוך fibroblasts. כדי לצמצם את מספר מיקרוגלייה, ניתן לנקוט בכמה צעדים: לשנות את המדיה מסלולית רועדת, טיפולים כימיים. ברגע טוהר התרבות הוא אישר immunofluorescence באמצ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות Paola לופס Pieraldi לסיוע טכני. A.H.M. הוא אסיר תודה עבור מענקים 8G12MD007600 ו- U54-NS083924 נתמך בפרסום זה. אנו מודים NIH-NIMHD-G12-MD007583 גרנט על התמיכה מתקן. D.E.R.A. הוא אסיר תודה על האחווה שסופקו על-ידי-NIHNIGMS-R25GM110513. אנחנו אסירי תודה על השימוש באזור מכשור המשותף ולהעניק הסיוע של ד ר Priscila Sanabria עבור השימוש במתקן הדמיה אופטית של התוכנית RCMI על ידי G12MD007583. בנוסף, אנו רוצים להודות חוסה פאדילה על תפקידו מצטיינים צילום ועריכה פרוטוקול חזותי.
Materials
| Instruments for Surgery – Step 1 | |||
| Operating scissor 5.5” | Roboz Company | RS-6812 | Tools used to decapitate the rats. |
| Curved forceps 7” | Roboz Company | RS-5271 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting scissors 4” | Roboz Company | RS-5882 | Cuts both the skin and skull of the rat. |
| Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp | Roboz Company | RS-5095 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 | Roboz Company | RS-5135 | Tool used to separate cortices. |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Company | RS-4972 | Peels brain meninges. |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Important for removing the meninge from the cortices. |
| DMEM Preparation – step 2 | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GibCo. Company | 11995-065 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| Filter System 1L with 0.22um pore | Corning | 431098 | |
| Astrocyte culture – step 3 | |||
| Serological pipets 5mL | VWR | 89130-896 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 10mL | VWR | 89130-898 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 25mL | VWR | 89130-900 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Centrifuge conical tube 15mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-200250 | |
| Safe-lock tube 1.5mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Barrier Tips 200 uL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201725 | |
| Barrier Tips 1 mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201727 | |
| Biohazard Orange Bag 14 x 19" | VWR | 14220-048 | |
| 60mm petri dishes | Falcon | 351007 | |
| Sterile gauze pads | Honeywell Safety | 89133-086 | |
| Stomacher 80 Biomaster | Sewar Lab System | 030010019 | Triturate the brain tissue. |
| Stomacher 80 Blender Sterile Bags | Sewar Lab System | BA6040 | Sterile bag for the stomacher cell homogenizer. |
| Beaker 400mL | Pyrex | 1000 | |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #60 | Sigma-Aldrich Company | S1020 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 | Sigma-Aldrich Company | S3895 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Invert phase microscope | Nikon | Eclypse Ti-S | Verify cells for contamination or abnormal cell growth. |
| 75cm2 sterile flasks | Falcon | 353136 | |
| Multi-well plate | Falcon | 353046 | |
| Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round | VWR | 48380-046 | |
| Bright-Line hemacytometer | Sigma-Aldrich Company | Z359629 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich Company | E7023 | |
| L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) | Sigma-Aldrich Company | L1002 | Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre. |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich Company | C1768 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 | Sigma-Aldrich Company | P0899 | |
| Trypsin/EDTA | GibCo. Company | 15400-054 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich Company | T8154 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich Company | W3500 | |
| OGD Medium Preparation – step 5 | |||
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose | Sigma-Aldrich Company | D5030 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| 200mM L-glutamine | GibCo. Company | 25030-081 | Amino acid that supplements the growth of cells. |
| Phospahet buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Filter System 50mL with 0.22um pore | Corning | 430320 | |
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SMF3001 | Measure gas flow in oxygen purge. |
| Hypoxia Incubator Chamber | StemCell | 27310 | Generates a hypoxic environment for the cell culture. |
| Traceable Dissolved Oxygen Meter | VWR | 21800-022 | |
| 95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture | Linde | Purges the environment of oxygen. | |
| primary astrocyte immunofluorescence – step 6 | |||
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Formaline Solution Neutral Buffer 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Solution used to fix cells. |
| Methanol | Fisher | A4544 | Solution used to fix cells. |
| Non-ionic surfactant (Triton X-100) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Anti-NeuN | Cell Signaling | 24307 | Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture. |
| Anti-PCNA | Cell Signaling | 2586 | Detects proliferating cells. |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich Company | P4170 | Apoptosis staining. |
| Anti-Olig1 | Abcam | AB68105 | Detects mature oligodendrocytes. |
| Anti-Iba1+ | Wako | 016-20001 | Detects microglial cells. |
| Anti-GFAP Conjugated with Cy3 | Sigma-Aldrich Company | C9205 | Detects reactive astrocytes in the treated cells. |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probe Life Technology | A1101 | Anti-Mouse Secondary Antibody |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probe Life Technology | A21428 | Anti-Rabbit Secondary Antibody |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich Company | D9542 | Nuclear staining |
| Confocal microscope | Olympus |
References
- Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. Interrater reliability of the NIH stroke scale. Arch Neurol. 46 (6), 660-662 (1989).
- Hinkle, J. L., Guanci, M. M. Acute ischemic stroke review. J Neurosci Nurs. 39 (5), 285-293 (2007).
- Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
- Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
- Ben Haim, L., Carrillo-de Sauvage, M. A., Ceyzeriat, K., Escartin, C. Elusive roles for reactive astrocytes in neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 9, 278 (2015).
- Broderick, J., et al. Guidelines for the Management of Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Adults 2007 Update: A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, High Blood Pressure Research Council, and the Quality of Care and Outcomes in Research Interdisciplinary Working Group: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Stroke. 38 (6), 2001-2023 (2007).
- Wang, R., et al. Oxygen-glucose deprivation induced glial scar-like change in astrocytes. PLoS One. 7 (5), e37574 (2012).
- Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes in neural repair and protection. The Neuroscientist. 11 (5), 400-407 (2005).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).
- Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PLoS One. 8 (3), e60282 (2013).
- Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
- Robinson, C., Apgar, C., Shapiro, L. A. Astrocyte Hypertrophy Contributes to Aberrant Neurogenesis after Traumatic Brain Injury. Neural Plast. , 1347987 (2016).
- Brekke, E., Berger, H. R., Wideroe, M., Sonnewald, U., Morken, T. S. Glucose and Intermediary Metabolism and Astrocyte-Neuron Interactions Following Neonatal Hypoxia-Ischemia in Rat. Neurochem Res. , (2016).
- Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
- Zhu, Z., et al. Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo. Glia. 55 (5), 546-558 (2007).
- Bovolenta, P., Wandosell, F., Nieto-Sampedro, M. Neurite outgrowth over resting and reactive astrocytes. Restor Neurol Neurosci. 2 (4), 221-228 (1991).
- Anderson, M. A., et al. Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration. Nature. 532 (7598), 195-200 (2016).
- Hao, C., Richardson, A., Fedoroff, S. Macrophage-like cells originate from neuroepithelium in culture: characterization and properties of the macrophage-like cells. Int J Dev Neurosci. 9 (1), 1-14 (1991).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
- Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16 (3), 282-292 (1998).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Pont-Lezica, L., Colasse, S., Bessis, A. Depletion of microglia from primary cellular cultures. Methods Mol Biol. 1041, 55-61 (2013).
- Svensson, M., Aldskogius, H. Synaptic density of axotomized hypoglossal motorneurons following pharmacological blockade of the microglial cell proliferation. Exp Neurol. 120 (1), 123-131 (1993).
- Wong, V. K., Shapourifar-Tehrani, S., Kitada, S., Choo, P. H., Lee, D. A. Inhibition of rabbit ocular fibroblast proliferation by 5-fluorouracil and cytosine arabinoside. J Ocul Pharmacol. 7 (1), 27-39 (1991).
- Nakatsuji, Y., Miller, R. H. Density dependent modulation of cell cycle protein expression in astrocytes. J Neurosci Res. 66 (3), 487-496 (2001).
- Reeves, J. P. Accumulation of amino acids by lysosomes incubated with amino acid methyl esters. J Biol Chem. 254 (18), 8914-8921 (1979).
- Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunol. 131 (5), 2282-2290 (1983).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
- Corvalan, V., Cole, R., de Vellis, J., Hagiwara, S. Neuronal modulation of calcium channel activity in cultured rat astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (11), 4345-4348 (1990).
- Butler, I. B., Schoonen, M. A., Rickard, D. T. Removal of dissolved oxygen from water: A comparison of four common techniques. Talanta. 41 (2), 211-215 (1994).
- Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods Mol Biol. 1254, 197-210 (2015).
- Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. J Vis Exp. (54), (2011).
- Rivera-Aponte, D., et al. Hyperglycemia reduces functional expression of astrocytic Kir4. 1 channels and glial glutamate uptake. Neuroscience. 310, 216-223 (2015).
- Berger, R., Garnier, Y., Pfeiffer, D., Jensen, A. Lipopolysaccharides do not alter metabolic disturbances in hippocampal slices of fetal guinea pigs after oxygen-glucose deprivation. Pediatric research. 48 (4), 531-535 (2000).
- Anderson, T. R., Jarvis, C. R., Biedermann, A. J., Molnar, C., Andrew, R. D. Blocking the anoxic depolarization protects without functional compromise following simulated stroke in cortical brain slices. Journal of neurophysiology. 93 (2), 963-979 (2005).
- Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. D. Anoxic depolarization mediates acute damage independent of glutamate in neocortical brain slices. Cerebral Cortex. 11 (3), 249-259 (2001).
