Metodología para el Estudio de la transferencia horizontal de genes en<em> Staphylococcus aureus</em
Summary
Se describe aquí tres protocolos diferentes para la investigación in vitro de la conjugación, transducción, transformación y natural en el Staphylococcus aureus.
Abstract
Una característica importante de la importante patógeno humano oportunista Staphylococcus aureus es su extraordinaria capacidad para adquirir rápidamente la resistencia a los antibióticos. Los estudios genómicos revelan que S. aureus lleva muchos genes de virulencia y resistencia situados en elementos genéticos móviles, lo que sugiere que la transferencia horizontal de genes (HGT) desempeña un papel crítico en la evolución S. aureus. Sin embargo, una descripción completa y detallada de la metodología utilizada para estudiar HGT en S. aureus que aún falta, especialmente en cuanto a transformación natural, que se ha informado recientemente en esta bacteria. Este trabajo describe tres protocolos que son útiles para la investigación in vitro de HGT en S. aureus: conjugación, transducción de fago, y la transformación natural. Para este objetivo, el gen CFR (cloranfenicol / resistencia florfenicol), que confiere los fenicoles, lincosamidas, oxazolidinonas, pleuromutilinas, ya la estreptogramina A (PhLOPSA) -Resistencia fenotipo, se utilizó. La comprensión de los mecanismos mediante los cuales S. aureus transfiere material genético a otras cepas es esencial para la comprensión de la rápida adquisición de resistencia y ayuda a clarificar los modos de difusión reportados en los programas de vigilancia o para predecir aún más el modo de difusión en el futuro.
Introduction
Staphylococcus aureus es una bacteria Gram-positiva comensal que habita de forma natural de la cavidad nasal y la piel de los seres humanos y animales. Esta especie bacteriana es la causa principal de las infecciones nosocomiales en los hospitales y establecimientos de salud. Además, su capacidad para desarrollar resistencia a los diferentes compuestos antimicrobianos ha hecho que el manejo de las infecciones causadas por esta bacteria en una preocupación mundial.
Se conocen dos vías principales que participan en la difusión de los fenotipos de resistencia: la diseminación clonal de genotipos resistentes y la difusión de los determinantes genéticos entre la piscina bacteriana. En el caso de S. aureus, diferentes genes de resistencia a antibióticos (así como determinantes de virulencia) se han encontrado para ser asociado con los elementos genéticos móviles (MGEs) 1. La presencia de estos elementos en el genoma de S. aureus indica que la adquisición y transferencia de genetic materiales dentro de la población bacteriana podría desempeñar un papel importante para S. aureus adaptación y evolución.
El material genético se puede intercambiar a través de tres mecanismos bien conocidos de HGT en bacterias Gram-positivas: transformación, conjugación, y la transducción de fago. La transformación implica la captación de ADN libre. Para adquirir el ADN extraño, las células bacterianas necesitan desarrollar una fase fisiológica especial: la etapa de la competencia. Cuando se alcanza esta etapa, las células competentes son capaces de transportar ADN en el citoplasma, la adquisición de nuevos determinantes genéticos. En el caso de S. aureus, la existencia de transformación natural se ha demostrado recientemente 2. En línea con esto, nuestro grupo ha arrojado luz sobre la relevancia de la expresión del factor de SigH (una transcripción secundaria críptica factor sigma) en la etapa de competencia de desarrollo y de cómo su expresión constitutiva hace S. aureus capaz de reaching la etapa de competencia, lo que permite la adquisición de fenotipos resistentes por transformación natural 2.
La conjugación es un proceso que implica la transmisión de ADN de una célula viva (donante) a otra (receptor). Tanto las células deben estar en contacto directo, permitiendo que el ADN que debe intercambiarse mientras protegida por estructuras especiales, tales como tubos o poros. La transferencia de ADN por este método requiere la maquinaria conjugativo. En S. aureus, el plásmido conjugativo prototipo es PGO1, que alberga el conjugativo TraA operón 3.
transducción de fago implica la transferencia de ADN de una célula a través de la infección del bacteriófago e implica el embalaje de ADN bacteriano, en lugar de ADN viral, en la cápside del fago. La mayoría de los aislados de S. aureus se lisogenizó por bacteriófagos 1. Tras condiciones de estrés, prophages pueden ser extirpados del genoma bacterianoey turno al ciclo lítico.
Estos son los tres mecanismos bien conocidos para la transmisión de ADN en S. aureus. Hay algunos mecanismos de transferencia adicionales, tales como "pseudo-transformación" 2 y sistemas de fagos como en la transferencia de islas de patogenicidad 4. Recientemente, un grupo informó de que "nanotubos" están involucrados en la transferencia de materiales celulares (incluyendo el ADN plásmido) entre las células vecinas 5, 6, pero un estudio de seguimiento no se ha manifestado de otros grupos hasta ahora.
Este trabajo proporciona la metodología necesaria para estudiar HGT en S. aureus, abordando las tres principales vías de transferencia de conjugación, la transducción y transformación natural. Los resultados obtenidos con estas metodologías se utilizaron para estudiar la transmisión del gen cfr (cloranfenicol / resistencia florfenicol) entre7 cepas de S. aureus. Estas tres técnicas son herramientas versátiles para la investigación de la transmisión MGE en S. aureus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabajo describe los tres métodos principales para estudiar la HGT de los determinantes genéticos en S. aureus. Aunque la transducción y conjugación se han estudiado durante décadas, la existencia de transformación natural fue reconocida sólo recientemente 2. De este modo, S. aureus está equipado con todos los tres principales modos de HGT, y prueba de todos ellos es necesaria para aclarar las posibles vías de difusión de los determinantes genéticos. El obj…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partly supported by Takeda Science Foundation, Pfizer Academic Contribution and JSPS Postdoctoral Fellowship for Foreign Researchers (FC).
Materials
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Becton Dickinson | 211825 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | 211059 | |
| Nutrient Broth No. 2 | Oxoid | CM0067 | |
| Sheep blood agar | Eiken Chemical Co.,Ltd. | E-MR96 | Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. |
| Agar powder | Wako Pure Chemical Industries | 010-08725 | |
| Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) | Wako Pure Chemical Industries | 191-01785 | |
| Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter | Merck Milipore | HAWG 02500 | |
| QIAfilter Plasmid Midi kit | QIAGEN | 12243 |
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