Estabelecimento de células tetraplóides proliferativa de fibroblastos humanos não transformadas
Summary
Although proliferative polyploid cells are necessary to analyze chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is not easy. The present report describes relatively simple procedures to establish proliferative tetraploid cells free of a diploid population from normal human fibroblasts.
Abstract
Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to be responsible for carcinogenesis in such tissues. Although proliferative polyploid cells are requisite for analyzing chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is rather challenging. Induction of tetraploidy by chemical agents usually results in a mixture of diploid and tetraploid populations, and most studies employed fluorescence-activated cell sorting or cloning by limiting dilution to separate tetraploid from diploid cells. However, these procedures are time-consuming and laborious. The present report describes a relatively simple protocol to induce proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts with minimum contamination by diploid cells. Briefly, the protocol is comprised of the following steps: arresting cells in mitosis by demecolcine (DC), collecting mitotic cells after shaking off, incubating collected cells with DC for an additional 3 days, and incubating cells in drug-free medium (They resume proliferation as tetraploid cells within several days). Depending on cell type, the collection of mitotic cells by shaking off might be omitted. This protocol provides a simple and feasible method to establish proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Tetraploid cells established by this method could be a useful model for studying chromosome instability and the oncogenic potential of polyploid human cells.
Introduction
Poliploidia foi observada não só em tecidos especializados de espécies de mamífero, mas também de uma variedade de condições patológicas, como o cancro e doenças degenerativas. Células poliplóides (principalmente tetraplóides) são muitas vezes observada em lesões pré-neoplásicas de tecidos humanos, tais como esófago 1,2 ou lesões intra-epiteliais escamosas de Barrett, do colo do útero 3,4, e foram considerados para ser a fonte de células malignas aneuploides nesses tecidos 5 , 6. Embora seja sugerido que a conversão de células tetraplóides para aneuploides poderia ser um evento essencial nas fases iniciais de tumorigénese, os mecanismos envolvidos no presente processo não são completamente compreendidos. Isto é em parte porque nenhum modelo in vitro tem sido disponível onde as células humanas não transformadas poliplóides pode se propagar.
Alguns investigadores induziram tetraploidia em células epiteliais humanas não transformadas através da geração de células binucleadas por INHibiting citocinese 7-9. Neste método, no entanto, as células diplóides desnecessárias devem ser eliminadas por activadas por fluorescência de células (FACS) 7,8 ou clonagem por diluição limitante 9. Porque esses procedimentos são trabalhosos e não é fácil de realizar, métodos mais simples para estabelecer células tetraplóides não transformadas são desejados para a investigação neste domínio.
No presente relatório, nós descrevemos um protocolo para estabelecer células tetraplóides de proliferação de fibroblastos humanos normais ou fibroblastos humanos imortalizados-telomerase através de procedimentos relativamente simples. Os procedimentos usar fuso demecolcina veneno (DC) para prender células diplóides na mitose e células mitóticas recolhidos por agitando fora são ainda tratados com DC. células mitóticas diplóides tratados com DC por tempo prolongado converter em células G1 tetraplóides, e essas células proliferar como células tetraplóides após a paragem do crescimento durante vários dias após a remoção de drogas. Este protocolo prevêum método eficiente para a criação de um modelo útil para estudar a relação entre a instabilidade dos cromossomas e o potencial oncogénico de células humanas poliplóides.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um problema importante na indução de tetraploidia a partir de células diplóides por agentes químicos, quer por inibidores de citocinese ou por inibidores do fuso, é que as células tornam-se muitas vezes uma mistura de populações diplóides e tetraplóides, e células tetraplóides têm de ser separados a partir de células diplóides. abordagens mais comuns para isolamento de uma população de células tetraplóides livre diplóides utilizar FACS ou clonagem por diluição limitante. No entanto, esses procedim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mrs. Matsumoto for the technical assistance.
Materials
| MEM-α | Sigma-Aldrich | M8042-500ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | |
| Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) | Sigma-Aldrich | D1925-10ML | |
| BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits | BD Biosciences | #340242 | For examination of DNA ploidy by flow cytometry |
| Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte | MetaSystems | #D-0125-060-DI | Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary |
| Isis imaging system with mFISH software | MetaSystems | Specialized probe kit is necessary |
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