Clostridium difficile est l' une des principales causes de diarrhées infections associées aux antibiotiques nosocomiales ^1. Cette bactérie anaérobie à Gram positif est transmis par sa forme de spores par voie fécale-orale. Dans la dernière décennie, le nouveau '' épidémie '' ou '' hypervirulent '' souches (par exemple BI / NAP1 / 027) a provoqué une augmentation drastique des nouvelles infections et des taux de mortalité en Amérique du Nord et en Europe ^2. C. maladie -Associated difficile (DACD) est un danger pour la vie du côlon inflammation avec des taux de létalité élevés ^3. Les symptômes vont de la diarrhée ⁴ à la colite pseudomembraneuse ⁵ et le mégacôlon toxique souvent mortelle ^6.

Le traitement de la DACD est difficile , car les souches virulentes sont multirésistante et le taux de récidive est élevé ^7. A la thérapie de couple comprend le métronidazole antibiotiques, fidaxomicine ou vancomycine, ou repetiticas récurrents de transplantation fécale vement du microbiote. De nouvelles stratégies thérapeutiques sont nécessaires d' urgence ^8. Certains progrès sont enregistrés en tant que thérapeutique anticorps monoclonal Bezlotoxumab, ciblant la toxine C. difficile B ^9, a récemment passé avec succès la phase III des essais cliniques et a été soumis à l' approbation de la FDA et de l' EMA. En outre, les nouveaux antibiotiques sont testées à l'heure actuelle à différents stades d'essais cliniques ^10.

Pour développer un traitement efficace de nouvelles cibles thérapeutiques doivent être identifiés. Récemment découvert C. protease difficile endopeptidase-1 proline-proline (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; CE 3.4.24.89) est une cible prometteuse, comme le manque de PPEP-1 dans une souche de knock-out diminue la virulence de C . difficile in vivo ^11. PPEP-1 sécrété est une métalloprotéase ^12,13 cliver deux adhésines de C. difficile à leur extrémité C-terminale ¹³ libérant ainsi l'adhérence bacterentre autres de l'épithélium de l'intestin humain. Par conséquent, il est impliqué dans le maintien de l'équilibre entre le phénotype et sessiles motiles de C. difficile. Pour développer des inhibiteurs sélectifs contre PPEP-1 et de comprendre comment il reconnaît ses substrats connaissance intime de sa structure tridimensionnelle est indispensable. Nous avons résolu la première structure cristalline de PPEP-1 seul ou en complexe avec un peptide substrat ^14. PPEP-1 est la première protéase connue qui clive sélectivement les liaisons peptidiques entre les deux résidus de proline ^15. Elle lie le substrat d'une manière double entortillé et stabilise via un réseau étendu aliphatique-aromatique de résidus situés dans le S-boucle qui couvre le site actif de la protéase ^14. Ce mode de liaison au substrat est unique à PPEP-1 et ne trouve pas dans les protéases humaines à ce jour. Cela en fait une cible de médicament prometteur, et les effets hors-cible des inhibiteurs très improbables.

Pour développer et écran sélective PPEP-1 inhibitors à l'avenir, une grande quantité de pur et monodisperse PPEP-1 protéine est nécessaire. En outre, pour déterminer le mode de liaison des premiers inhibiteurs, des structures co-cristallines avec PPEP-1 devra être déterminée. Dans nos mains PPEP-1 produit constamment cristaux enchevêtrés. Ainsi, nous avons mis au point une procédure d'optimisation pour produire des cristaux simples Diffraction qualité de PPEP-1. Dans ce protocole , nous décrivons en détail la solution de PPEP-1 ¹⁴ production, la purification, la cristallisation et de la structure. Nous utilisons l' expression intracellulaire dans Escherichia coli d'une variante PPEP-1 dépourvu de la séquence signal de sécrétion, une Chromatographie d' affinité et Chromatographie d'exclusion de taille avec l' enlèvement de l'étiquette de purification, suivie microseeding ¹⁶ dans un écran d'optimisation et la détermination de la structure par l' intermédiaire du zinc longueur d' onde unique dispersion anormale (zinc-SAD) ^17. Ce protocole peut être adapté pour la production et la détermination de la structure d'autres protéines (par exemple </ Em> métalloprotéases) et en particulier pour les protéines produisant des cristaux enchevêtrés. Sur demande, l'ADN plasmidique de la construction (pET28a-NHis-rPPEP-1) Les données de diffraction et peut être fourni à des fins éducatives.