Eficiente e Rotulagem de anticorpos por cicloadição Azide-alcino promoveu-Strain Site-specific
Summary
Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).
Abstract
Atualmente muitas ferramentas químicas disponíveis para introduzir sondas químicas em proteínas para estudar sua estrutura e função. Um método útil é a conjugação de proteínas geneticamente pela introdução de um aminoácido não natural contendo um grupo funcional bioorthogonal. Este relatório descreve um protocolo detalhado para site-specific a conjugação de anticorpos. O protocolo inclui detalhes experimentais para a incorporação genética de um aminoácido contendo azida, e a reacção de conjugação por cicloadição azida-alcino promoveu-deformação (SPAAC). Esta reacção promovida por deformação prossegue por mistura simples das moléculas de reacção a pH e temperatura fisiológicos, e não requer reagentes adicionais, tais como cobre (I) e os iões ligandos quelantes de cobre. Por conseguinte, este método seria útil para a conjugação de proteínas em geral e ao desenvolvimento de conjugados de anticorpo e fármaco (ADCs).
Introduction
Uma vez que a incorporação genética de p -methoxyphenylalanine em Escherichia coli foi relatado, 1 mais de 100 aminoácidos não naturais (UAAS) foram incorporados com sucesso em várias proteínas. 1-3 Entre estes UAAS, os aminoácidos contêm grupos funcionais bioorthogonal têm sido extensivamente estudados e representam a maior proporção. Os grupos funcionais bioorthogonal utilizados nos UAAS incluem cetona, 4 azida, alcino 5, 6 cyclooctyne, tetrazina 7, 8 α, amida β-insaturado, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 e biciclo [6.1.0] -nonyne. 11 Embora cada grupo funcional tem as suas vantagens e desvantagens, os aminoácidos contendo azida foram mais extensivamente utilizada para a conjugação de proteínas. p -Azidophenylalanine (AF), um dos aminoácidos contendo azido, está prontamente disponível, e a sua incorporação efficiency é excelente. pode-se fazer reagir as proteínas mutantes contendo este aminoácido com alcinos por cicloadição catalisada por cobre ou com cyclooctynes por SPAAC. 12-20
Recentemente, biofármacos têm atraído muita atenção na indústria farmacêutica. O conjugado anticorpo-fármaco (ADC) é uma classe de anticorpos terapêuticos que são vantajosos devido à sua capacidade para terapia-alvo para o tratamento de cancros humanos e 21 outras doenças. Mais de 50 ADCs estão actualmente em ensaios clínicos, eo número está aumentando rapidamente. No desenvolvimento dos ADCs, muitos factores devem ser considerados para maximizar a eficácia e minimizar os efeitos colaterais. Entre estes factores, a reacção de conjugação eficiente e específica do local para formar uma ligação covalente entre um anticorpo e um fármaco é crítica. A eficiência e especificidade desejada na reacção de conjugação pode ser conseguida por conjugação com um grupo funcional numa bioorthogonalaminoácido não natural que é especificamente incorporada num anticorpo. 22-26 Aqui, nós relatamos um protocolo para o site especificamente incorporar AF em um fragmento de anticorpo e o conjugado do fragmento de anticorpo mutante com uma sonda bioquímica.
Protocol
Representative Results
Discussion
A incorporação genética de aminoácidos não naturais em proteínas tem várias vantagens sobre outros métodos utilizados para a modificação de proteínas. 3/1 Uma das vantagens importantes é a sua aplicabilidade em geral a qualquer tipo de proteína. Em princípio, não há limitação na escolha de uma proteína alvo e um local alvo da proteína. No entanto, a substituição de um resíduo estruturalmente ou funcionalmente importante com um UAA pode resultar na alteração da estrutura e função da …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 1. plasmid Construction | |||
| plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500g |
| 2. Culture preparation | |||
| 2.1) Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100ML |
| 3. Expression and purification of HerFab-L177AF | |||
| 3.1 Expression of Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1g |
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500ml |
| 3.2 Cell lysis | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500g |
| EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1kg |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 500g |
| Lysozyme | Siyaku | 126-0671 | 1g |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25ml |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1ml capacity |
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1kg |
| 4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
| 5. Purification of Labeled HerFab | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
| 6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10ml |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500ml |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25g |
| Typhoon 9210 variable mode imager | Amersham Biosciences |
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