하이 브리 도마 기술에 의해 쥐 단일 클론 항체의 생성
Summary
An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.
Abstract
Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.
Introduction
이 프로토콜에 제시된 하이 브리 도마 기술은 처음 쾰러와 1975 년 밀스타인 (1)에 의해 설명하고, 몇 가지 기술적 인 개선을 제외하고 주요 절차는 지난 40 년 2 동안 크게 변경되지 않았습니다. 이 프로토콜의 목적은보다 적절한 면역화 전략, 모노클로 날 항체의 생성 표준 방법 및 검증 방법 (ELISA)에 대한 예를 설명한다.
항체는 놀라운 도구 질병 모니터링 및 처리 3에 대한 진단 및 치료 옵션뿐만 아니라 이러한 유세포 자기 세포 분류, 또는 면역 같은 기술적 접근법 광범위한 기여한다. 원하는 목표에 대한 단일 클론 항체의 상용화는 항체 또는 항체 관련 제품 (4)의 거의 셀 수없이 많은 수량 24 개 이상의 서로 다른 웹 데이터베이스의 존재에 의해 설명된다. 2015에서,ntibody 분자 인해 적절한 검증 및 상업적으로 이용 가능한 항체의 특성에 심각한 문제로 국제 논의 5-7의 일부.
표적 항원에 특이적인 항체를 찾기 어렵고 고가 일 수 있고, 종종, 이들은 친 화성 또는 특이성은 필요 없다. 항체를 생성하는 것은 아직 시간이 많이 걸리는이며, 수도 더 나은 하나를 구입하는 것보다 개별적으로 항체를 생산, 개발 및 항체를 확인하는 숙련 된 인력이 필요하지만.
인해 항체 생산은 시간 소모적이며, 경험을 필요로한다는 사실에 결합 분자의 제조를위한 다른 방법은 이러한 문제를 극복하기 위해 개발되었다. 가장 일반적으로 사용되는 다른 방법은 파지 디스플레이를 통해 단일 쇄 항체의 재조합 생성한다. 가변 결합 영역의 유전자는 세포로부터 추출하고, 파지의 코트 단백질과 결합된다. 의 S화롯불 체인은 박테리오파지의 표면에 발현 여러 패닝 단계 8에서 상영된다. 단일 사슬 항체의 생산은 다소 빠르지 만 또한 숙련 된 실험자를 필요로한다. 일부 재조합 단일 사슬 항체의 단점은 가난한 안정성 및 체외 진단을위한 적합성의 부족이다. 대부분의 진단 시험에서 검출을위한 된 Fc 수용체 나중에 재조합 단일 쇄 항체에 추가 될 필요가있는 것이 필요하다. 또한, 이것은 시간을 소모하고, 하이 브리 도마 기술보다 훨씬 더 복잡하다. 체외 진단에서 전체 길이 단일 클론 마우스와 토끼 항체는 최선의 선택이 될 입증되었습니다.
면역 접합체의 설계 : 실험실 작업을 시작하기 전에 단일 클론 항체를 생성하는 주요 단계 중 하나는 수행되어야한다. 해결해야 할 질문은 다음과 같습니다 최종 응용 제품에서 대상의 물리적 조성은 무엇입니까이온 및 존재하는 행렬? 대상은 응용 프로그램에서 어떤 농도가 있습니까? 최종 응용 프로그램은 무엇이며, 항체가 충족해야하는 요구 사항은 무엇입니까?
항상 선형 펩티드 단편을 사용하는 경우, 또한 원하는 대상의 최종 선형 에피토프되어야한다는 고려; 그렇지 않은 경우, 항체에 결합하지 않을 것이다. 물론, 스크리닝 방법과 무관하게 항체는 서로 다른 애플리케이션의 서로 다른 형식의 항원을 인식하도록 선택 될 수 있지만, 이것은 매우 정밀하게 검증되어야한다. 이러한 항체 개발 및 유효성 검사는 야심 찬 프로세스입니다 이유입니다.
면역 항원에 대한 포맷의 선택은 항체 개발을위한 기본이며,이 방법의 성공 또는 실패를 결정한다. 생쥐가 중요한 항체를 발현하면, 비장 세포를 분리하여 골수종 세포와 융합된다. 가장 일반적인 골수종 세포주쥐의 모노클로 날 항체 개발은 X63-의 Ag 8.653 (9) 및을 Balb / C 마우스 변형에서 Sp2을 / 0의 Ag (14) (10)이다. 세포는 악성 B 세포 림프종의 자손 그들 자신의 중량 또는 경쇄 중 어느 분비하지 않기 때문에 선택되었다. 1 (골수종 세포 대 비장) 세포를 1:10 내지 10의 비율로 구성 될 수있다. Stoicheva 및 귀 (11)에있어서, (1) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 전기 융합하여 융합이 프로토콜에서, 세포는 3의 비율로 적응시켰다.
B 세포와 골수종 세포의 융합은 임의의 공정이다. 따라서, 두 개의 B 림프구 또는 골수종 세포의 하이브리드를 생성 할 수 있지만, 이러한 하이브리드 배양 장기간 생존 할 수 없다. 세포는 하이 브리 도마 세포 융합 의한 피리 미딘 합성 새로이 경로를 사용할 수있는 가능성에 견딜 수있는하여 하이포크 산틴, 아미 노프 테린 및 티미 딘 (HAT)을 둘러 거칠. 월의 생성oclonal 항체, 한 머더 세포 유래 세포주를 얻기 위해 필요하다. monoclonality는 희석 기술 및 세포 증식의 현미경 분석을 제한함으로써 보장된다. 하이 브리 도마 배양 상청액은 ELISA에 의해 주로, 특이 적 항체 생산에 대해 스크리닝 또는 유동 세포 계측법 및 가장 바인더가 선택된다. 대량 배양 및 정제 한 후, 항체 분자는 마침내 특성화 될 수 있으며, 원하는 애플리케이션에 대한 검증.
Protocol
Representative Results
Discussion
하이 브리 도마 기술에 의해 모노클로 날 항체의 생성은 항체가 대상을 인식해야 할 때, 특히 최종 애플리케이션에 대하여, 강한 상세한 에피토프 분석을 요구한다. 이것은 종종 사용자가 과소 평가 약한 공연 항체에 이르게된다. 융합 프로세스는 특정 하이 브리 도마의 결과가이 시점에서 셀 비율과 활력에 크게 의존하는 것을 의미하는, 항상 랜덤이다. 제한 희석 한 후, 셀은 매우 불안정하며, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, “Artificial immune reactions,” “Camelid antibodies,” and “Antibody technologies.” We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.
Materials
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
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