La génération d'anticorps monoclonaux murins par Hybridoma Technology
Summary
An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.
Abstract
Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.
Introduction
La technologie d'hybridome présenté dans ce protocole a été décrite par Köhler et Milstein 1 en 1975 et, sauf pour quelques améliorations techniques, la procédure principale n'a pas changé de façon spectaculaire au cours des 40 dernières années 2. L'objectif de ce protocole est d'expliquer une stratégie plus appropriée de vaccination, une méthode standard pour la production d'anticorps monoclonaux, et un exemple pour une méthode de validation (ELISA).
Les anticorps sont des outils incroyables et contribuent à un large éventail d'approches technologiques, telles que la cytométrie de flux, le tri magnétique de cellules, ou immunofluorescence, ainsi que des options diagnostiques et thérapeutiques pour le suivi et le traitement 3 maladies. La disponibilité commerciale des anticorps monoclonaux pour les cibles désirées est démontrée par la présence de plus de 24 bases de données de Web différents avec pratiquement innombrables quantités d'anticorps ou de produits liés à l' anticorps 4. En 2015, unmolécules ntibody faisaient partie d'une discussion internationale 5-7 en raison de graves problèmes dans la validation et la caractérisation des anticorps disponibles dans le commerce approprié.
Il peut être difficile et coûteux de trouver des anticorps spécifiques pour un antigène cible, et souvent, ils n'ont pas l'affinité ou la spécificité nécessaires. Bien que la génération d'un anticorps est encore temps et nécessite du personnel qualifié pour développer et valider l'anticorps, la production d'un anticorps individuel pourrait mieux que d'acheter un.
En raison du fait que la production d'anticorps est longue et nécessite de l'expérience, les méthodes alternatives pour la production de molécules de liaison ont été développées pour surmonter ces problèmes. La méthode alternative la plus couramment utilisée est la production par recombinaison d'anticorps à chaîne unique par expression phagique. Les gènes codant pour la région variable de liaison sont extraits à partir des cellules et combinées avec la protéine de revêtement de phage. Les sChaîne ingle est ensuite exprimé sur la surface d'un bactériophage et criblé en plusieurs étapes panning 8. La production d'anticorps à chaîne unique est un peu plus rapide, mais il faut aussi un expérimentateur qualifié. Les inconvénients de certains anticorps à chaîne unique recombinantes sont une mauvaise stabilité et un manque d'aptitude pour le diagnostic in vitro. Dans la plupart des tests de diagnostic, un récepteur Fc de détection est nécessaire, qui doit être ajouté à un anticorps à chaîne unique recombinante après. Encore une fois, cela prend beaucoup de temps et d'autant plus complexe que la technique des hybridomes. Dans le diagnostic in vitro, des anticorps pleine longueur souris monoclonal et de lapin ont été démontrés pour être le meilleur choix.
L'une des principales étapes de la production d'anticorps monoclonaux doit être fait avant que le travail dans le laboratoire commence: la conception de l'immunoconjugué. Les questions qui doivent être abordées sont: Quelle est la composition physique de la cible dans la applicat finaleion, et qui matrices sont présents? Quelle concentration la cible avoir dans l'application? Quelle est l'application finale, et quelles sont les exigences que l'anticorps doit remplir?
Il faut toujours prendre en compte que si un fragment de peptide linéaire est utilisé, il doit également être linéaire dans l'épitope finale dans la cible de choix; sinon, l'anticorps ne se lie pas. Bien entendu, indépendamment de la méthode de criblage, les anticorps peuvent être sélectionnés pour reconnaître différents formats antigéniques dans des applications différentes, mais cela doit être validé de façon très précise. Ce sont les raisons pour lesquelles le développement d'anticorps et de validation sont ces processus ambitieux.
Le choix du format antigénique pour l'immunisation est fondamentale pour le développement d'anticorps et détermine le succès ou l'échec de ce processus. Une fois que les souris expriment un titre d'anticorps approprié, les cellules de rate sont isolées et fusionnées avec des cellules de myélome. Les lignées cellulaires de myélome les plus courants pourle développement murin d'anticorps monoclonaux sont X63-Ag 8.653 9 et Sp2 / 0-Ag 14 10 à partir d' un / c souche de souris Balb. Les cellules descendent d'un lymphome des cellules B malignes et ont été choisis parce qu'ils ne sécrètent une quelconque de leurs chaînes lourdes ou légères. Les cellules peuvent être adaptées à un rapport compris entre 1:10 et 10: 1 (splénocytes par rapport aux cellules de myélome). Dans ce protocole, les cellules ont été adaptées à un rapport de 3: 1 et fusionnés par le polyéthylène glycol (PEG) et électrofusion, selon Stoicheva Hui et 11.
La fusion des cellules B et des cellules de myélome est un processus aléatoire. Par conséquent, les hybrides de deux lymphocytes B ou de deux cellules de myélome peuvent être produites, mais ces hybrides ne seraient pas capables de survivre pendant une longue période de culture. Les cellules subissent une hypoxanthine, de l' aminoptérine et de la thymidine (HAT) la sélection, par lequel seules les cellules d'hybridome fusionnées peuvent survivre en raison de la possibilité d'utiliser la voie de novo de la synthèse des pyrimidines. Pour la génération de monoclonal anticorps, il est nécessaire d'obtenir une lignée cellulaire provenant d'une cellule mère. La monoclonalité est assurée en limitant les techniques de dilution et l'analyse microscopique de la croissance cellulaire. Les surnageants de culture d'hybridomes sont criblés pour la production d'anticorps spécifiques, la plupart du temps par la méthode ELISA ou cytométrie de flux, et les meilleurs liants sont sélectionnés. Après que la culture et la purification de masse, la molécule d'anticorps peut enfin être caractérisé et validé pour l'application souhaitée.
Protocol
Representative Results
Discussion
La génération d'anticorps monoclonaux par la technologie des hybridomes nécessite une analyse épitopique intense et détaillée, notamment en ce qui concerne l'application finale, lorsque l'anticorps doit reconnaître la cible. Ceci est souvent sous-estimée par les utilisateurs et conduit à des anticorps avec des performances faibles. Le processus de fusion est toujours aléatoire, ce qui signifie que le résultat d'hybridomes spécifiques est très dépendant du rapport de la cellule et la vitalit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, “Artificial immune reactions,” “Camelid antibodies,” and “Antibody technologies.” We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.
Materials
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 7 (256), 495-497 (1975).
- Hanack, K., Messerschmidt, K., Listek, M., Böldicke, T. Antibodies and Selection. Protein Targeting Compounds. , 11-22 (2015).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks. Nat Biotechnol. 32 (10), 992-1000 (2014).
- Pauly, D., Hanack, K. How to avoid pitfalls in antibody use. F1000 Res. 7 (4), 691-698 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 5 (518), 27-29 (2015).
- Polakiewicz, R. D. Antibodies: The solution is validation. Nature. 26 (518), 483 (2015).
- Baker, M. Antibody anarchy: A call to order. Nature. 26 (527), 545-551 (2015).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J Immunol. 123 (4), 1548-1550 (1979).
- Shulman, M., Wilde, C. D., Köhler, G. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature. 16 (276), 269-270 (1978).
- Stoicheva, N. G., Hui, S. W. Electrically induced fusion of mammalian cells in the presence of polyethylene glycol. J Membr Biol. 141 (2), 177-182 (1994).
- Osterhaus, A. D., Uytdehaag, A. G. Current developments in hybridoma technology. Tijdschr Diergeneeskd. 15 (110), 835-839 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 798-802 (2004).
- Vitetta, E. S., Baur, S., Uhr, J. W. Cell Surface Immunoglobulin II. Isolation and characterization of immunoglobulin from mouse splenic lymphocytes. Journal of experimental medicine. 134, 242-264 (1971).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines. Trends Biotechnol. 25 (9), 425-432 (2007).
- Holmes, P., Al-Rubeai, M. Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors. J Immunol Methods. 19 (230), 141-147 (1999).
- Weaver, J. C., McGrath, P., Adams, S. Gel microdrop technology for rapid isolation of rare and high producer cells. Nat Med. 3 (5), 583-585 (1997).
- Messerschmidt, K., Hempel, S., Holzlöhner, P., Ulrich, R. G., Wagner, D., Heilmann, K. IgA antibody production by intrarectal immunization of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus. Eur J Microbiol Immunol. 2 (3), 231-238 (2012).
- Listek, M., Micheel, B., Hanack, K. Biomoleküle freisetzende zelle und deren selektion mittels eines oberflächenproteins. neweramabs GmbH. , (2014).
