Messa Istologia per quantificare neurodegenerazione in<em> Drosophila</em
Summary
Drosophila è ampiamente usato come sistema modello per studiare neurodegenerazione. Questo protocollo descrive un metodo con cui la degenerazione, come determinato dalla formazione vacuolo nel cervello, può essere quantificato. Si riduce anche effetti dovuti alla procedura sperimentale di elaborazione e controllo sezionamento e mosche sperimentali come un campione.
Abstract
malattie neurodegenerative progressive come la malattia di Alzheimer (AD) o malattia di Parkinson (PD) è una crescente minaccia per la salute umana in tutto il mondo. Sebbene i modelli di mammiferi hanno fornito importanti informazioni sui meccanismi alla base della patogenicità, la complessità dei sistemi di mammiferi insieme con i loro alti costi stanno limitando il loro utilizzo. Pertanto, il semplice ma ben consolidata modello di sistema Drosophila fornisce un'alternativa per lo studio dei meccanismi molecolari che sono colpite in queste malattie. Oltre a deficit comportamentali, malattie neurodegenerative sono caratterizzate da fenotipi istologici come la morte neuronale e assonopatia. Per quantificare la degenerazione neuronale e per determinare come esso è influenzato da fattori genetici e ambientali, usiamo un approccio istologico che si basa sulla misurazione dei vacuoli nel cervello mosca adulta. Per ridurre al minimo gli effetti di errore sistematico e di confrontare direttamente le sezioni di controllo e expmosche erimental in una preparazione, si usa il metodo 'collare' per le sezioni di paraffina. Neurodegeneration viene valutata misurando la dimensione e / o il numero di vacuoli che si sono sviluppate nel cervello mosca. Questo può essere fatto sia concentrandosi su una specifica regione di interesse o analizzando l'intero cervello ottenendo sezioni seriali che attraversano la testa completa. Pertanto, questo metodo permette di misurare non solo la degenerazione grave, ma anche fenotipi relativamente lievi che sono rilevabili solo in alcune sezioni, come avviene durante il normale invecchiamento.
Introduction
Con l'aumento dell'aspettativa di vita, malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer o di Parkinson sono diventati una minaccia per la salute crescente per la popolazione generale. Secondo il National Institutes of Health, 115 milioni di persone nel mondo sono previsti per essere colpiti da demenza nel 2050. Anche se sono stati compiuti progressi significativi per identificare geni e fattori di rischio coinvolti in almeno alcune di queste malattie, per molti di loro, il sottostante meccanismi molecolari sono ancora sconosciuti o non ben compreso.
Semplici invertebrati organismi modello come Caenorhabditis elegans e Drosophila melanogaster offrono una varietà di vantaggi sperimentali per studiare i meccanismi di malattie neurodegenerative, tra cui un breve ciclo di vita, gran numero di discendenti, e la disponibilità di metodi ben consolidati e, a volte unici genetici e molecolari 1 -12. Inoltre, questi organismi sono suscettibili di imparzialeschermi di interazione in grado di identificare i fattori che contribuiscono a queste malattie per i loro effetti aggravanti o Ameliorating sui fenotipi neurodegenerative.
Analizzando tali interazioni genetiche e valutare gli effetti dell'invecchiamento richiede protocolli quantitativi per rilevare neurodegenerazione e misurare la sua gravità. Questa valutazione può essere fatta in modo relativamente facile quando si misura aspetti comportamentali di Drosophila, quali l'apprendimento olfattivo, geotassi negativi, o fototassi veloce, che forniscono un valore numerico delle prestazioni 13-21. È anche possibile determinare gli effetti sulla sopravvivenza neuronale contando neuroni. Tuttavia, questo è possibile solo quando concentrandosi su una specifica popolazione che è chiaramente identificabile, come i neuroni dopaminergici che sono interessati nel PD, e anche allora, i risultati sono stati controversi 22-24.
Il protocollo qui descritto utilizza il metodo collare per eseguire sezioni seriali paraffina, un metodoche è stato originariamente sviluppato da Heisenberg e Böhl, che lo utilizzò per isolare i mutanti cerebrali anatomiche in Drosophila 25. L'utilizzo del metodo collare è stato successivamente adattato, anche in criosezioni, vibratome sezioni e profilati in plastica 26-28. Ecco, questo metodo viene utilizzato per ottenere sezioni seriali di tutta la testa mosca, che può quindi essere utilizzato per misurare i vacuoli che si sviluppano in mosche con fenotipi neurodegenerative 16,21,29-32. Queste misurazioni possono essere eseguite in specifiche aree cerebrali o in grado di coprire l'intero cervello; il secondo approccio permette di identificare anche fenotipi degenerative deboli, come osservato durante l'invecchiamento. Infine, quando si utilizzano i collari, fino a 20 in linea può essere elaborato come una preparazione, che è non solo meno tempo, ma consente anche per l'analisi di controllo e mosche sperimentali nella stessa preparazione, minimizzando artefatti da lievi variazioni la preparazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo descritto fornisce un mezzo per quantificare neurodegenerazione nel cervello di Drosophila. Mentre altri metodi, come conteggio di un tipo di cellula specifico, possono essere utilizzati per identificare neurodegenerazione, il vantaggio di questo metodo è che può essere applicata più in generale. Contare le cellule richiede che queste cellule possono essere identificate in modo affidabile utilizzando un anticorpo specifico o l'espressione di un marcatore specifico per cellule, che non è sempre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants to D.K. from the Medical Research Foundation of Oregon and from NIH/NINDS (NS047663). E.S. was supported by a training grant from the NIH (T32AG023477).
Materials
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalog Number | |
| Collar | Genesee Scientific | TS 48-100 | We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A discription to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html |
| Rubber ice cube tray for embedding | Household store | The size can be made to fit by glueing in additional walls | |
| Crystallizing dish | Fisher Scientific company | 08-762-3 | |
| Ether | Fisher Scientific Company | E138-1 | |
| Ethanol | Decon Laboratories Inc. | 2701 | |
| Choloroform | Fisher Scientific Company | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific Company | A38-212 | |
| Methylbenzoate | Fisher Scientific Company | M205-500 | Distinct Odor |
| Use in fume hood | |||
| Low Melting Point Paraffin Wax | Fisher Scientific Company | T565 | Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath |
| Microtome | Leica Biosystems | Reichert Jung 2040 Autocut | |
| Microscope Slide | Fisher Scientific Company | 12-550D | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific Company | 12-545-M | |
| SafeClear | Fisher Scientific Company | 314-629 | Three different containers for washes |
| Vertical Staining Jar with Cover | Ted Pella Inc. | 432-1 | |
| Permount | Fisher Scientific Company | SP15-500 | |
| Poly-L-lysine Solution | Sigma Life Science | P8290-500 |
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