Subretinal Space erişim için bir alternatif ve Onaylı Enjeksiyon Yöntemi<i> yoluyla</i> Bir transkleral Posterior Yaklaşım
Summary
Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.
Abstract
Subretinal enjeksiyonları başarıyla doğrudan fotoreseptör maruz kalma ve retina pigment epitel (RPE) sahiptir interfotoreseptör / subretinal bölmeye proteinlerin terapötik girişimlerin viral ajanlar, ve hücreleri sunmak için insanlar ve kemirgenler hem de kullanılmıştır. plazminojen subretinal enjeksiyonları yanı sıra son klinik öncesi ve klinik çalışmalarda ileri retina hastalığı olan bireylerin viral vektörlerin ve kök hücreleri sunma güvenliğini ve / veya etkinliğini göstermiştir. retina hastalıkları, özellikle de kalıtsal retinal distrofilerin fare modelleri, bu tedavilerin test etmek için gereklidir. Kemirgenlerde en yaygın enjeksiyonundan retinaya bir anterior küçük transkorneal ya transkleral kesiler kullanmaktır. Bu yaklaşımla, enjeksiyon iğnesi altında yatan RPE ve yerleştirilmesine bozarak nörosensöriyel retina nüfuz kolayca nick lens, lens kesafeti ve non-invaziv IMAGI bozulmasını nedenng. Bir transkleral yoluyla subretinal alan erişme, posterior yaklaşım bu sorunları önler: iğne retina penetrasyon olmadan, optik sinir yaklaşık 0.5 mm sklerasına geçer ve vitrözü kesintiye önler. Tali hasar odak sklerotomili ve geçici, seröz retina dekolmanı etkileri ile bağlantılı olduğu sınırlıdır. yöntemin basitliği, göz yaralanması en aza indirir hızlı retina yatıştırıldı ve iyileşme sağlar ve düşük başarısızlık oranı vardır. retina ve RPE minimal hasar etkinliğinin net değerlendirme ve terapötik ajanların kendilerini doğrudan etkileri için izin verir. Bu yazıda, viral vektörler, farmakolojik ajanlar hedef yüksek etkinlik, en az hasar ve hızlı bir iyileşme ile farelerde retina altı alana hücreleri ya da uyarılmış pluripotent kök (IPS) kök hücreler için kullanılabilecek yeni bir retina altı enjeksiyon tekniği tarif etmektedir.
Introduction
Subretinal enjeksiyonları fotoreseptör ve altta yatan RPE 1,2 üzerindeki etkilerini incelemek için farelerin retina hücresel ve viral ajanlar sunan birincil yolu vardır. Farelerde en subretinal enjeksiyon protokolleri transkorneal veya ekvatora bir transkleral enjeksiyon sitesi anterior (Şekil 1) kullanın. Bu yaklaşım nicklemek ve lens bileşke bulanıklığı, retinada ve iris, retina kanaması, önemli retina dekolmanı ve kalıcı subretinal ödem 3-9 camsı, penetrasyon bütünlüğünün bozulması içeren doğal kollateral hasara neden olabilir. Deneysel manipülasyonlar terapötik girişimlerin 3,7,10,11 etkilerini değerlendirmek amacıyla bu etkileri aşmak gerekir. Bu çalışma, bu komplikasyonları önler posterior transkleral enjeksiyon yöntemi ayrıntılı bir açıklamasını ve doğrulama sağlayan travmayı en aza indirir ve alt hedefleme yüksek bir başarı oranına sahiptirretina alanı.
Farelerde subretinal alan hedefleme Enjeksiyonlar genellikle gerçekleştirmek çok zordur ve çoğu araştırmacı vektör yanlış bir konuma teslim edilir veya önemli retina hasarı tam retina dekolmanı 6 örneğin, var olduğu başarısız girişimleri yüksek frekanslı karşılaşıyoruz. Çünkü enjeksiyon komplikasyonlar analize dahil gözlerin sayısı genellikle fare çalışmalarında rapor değil, ama bizim kendi deneyim ve diğer araştırmacılar ile tartışmaya başarısız enjeksiyon sayısı% 50 kadar yüksek olabilir ve deneyime bağlı olarak değişebilir ve enjeksiyonları gerçekleştiren araştırmacının yetenekleri. Enjeksiyon başarısı genellikle direkt fundus görüntüleme ve / veya optik koherens tomografi (OKT) 7,9 değerlendirilir. Farelerde subretinal enjeksiyon için yüksek başarı oranları ile kolayca hakim yöntem deneme hızlandırmak ve tre klinik öncesi çalışmalarda maliyetini düşürebilirABD'de körlüğün başlıca nedenleridir retina hastalıkları için atments.
Arka, burada açıklanan transkleral subretinal enjeksiyon tekniği klinik ve klinik öncesi protokoller 9,12 bir uyarlamasıdır. enjekte edilen farelerde yapılan girişimsel olmayan tanı değerlendirmeler hafif ve son derece lokalize hasara göstermek ve ek teminat objektif, retina ve RPE hasarı yoksundur. böylece bu çalışmalarla ilgili maliyetlerin azaltılması, – (% 90 ya da daha iyi 80) Ayrıca, nispeten daha az uygulama ile, bir deneyci yüksek başarı oranı ile bu sonuçlar elde edebilirsiniz. Bu prosedür klinik öncesi çalışmalarda fotoreseptör ve / veya RPE, hücresel viral veya farmakolojik tedavi edici girişimler sunmak için ve kolayca deneysel müdahaleleri değerlendirmek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Subretinal enjeksiyonları viral vektörlerin teslimat için tercih edilen yöntem ve fotoreseptör ve temel araştırma ve klinik tedavisinde hem de RPE işlemek için hücre kökenli tedavisi kaynaklanıyor. hastalarda, subretinal enjeksiyonları genellikle doğrudan görselleştirme ile iğne ile, pars plana bir ön sklerotomili retinanın bir arka çekirdek vitrektomi ve penetrasyon yapılır. Göz Psödofakik zaten olmadıkça katarakt oluşumu erken gerçekleşmesi için en vitrektomi prosedürleri gibi, yaygınd?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge support by the Harold and Pauline Price Chair in Ophthalmology and the Jules Stein Eye Institute to MBG, the NEI Core grant (EY00331-43) to SN. Research was supported in part by a generous gift from the Sakaria family to SN and MGB, and from an unrestricted grant from the Research to Prevent Blindness to the Department of Ophthalmology. We thank Charlotte Yiyi Wang at Berkeley School of Optometry for obtaining initial OCT images of subretinal injections.
Materials
| Hamilton Model 62 RN SYR | Hamilton | 87942 | Syringe x 1 |
| Hamilton Needle 33G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel) | Hamilton | 7803-05 | Needles x 6 |
| Vannas Curved Scissors | Ted Pella, INC. | 1347 | 5mm Blade |
| 22.5 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 91204 | |
| Ketaject | Phoenix | NDC 57319-609-02 | Ketamine |
| Anased | Lloyd Laboratories | NDC 61311-482-10 | Xylazine |
| Fluorescein 10% AK-Fluor | Akorn | NDC 17478-253-10 | 100mg/ml |
| 0.9% Saline USP | Hospira | NDC 0409-4888-50 | 0.9% NaCl |
| Antibiotic Ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | Ophthalmic |
| Water Circulating Pump | Gaymar | TP-500 T/Pump | P/N 07999-000 |
| sd-OCT | Bioptigen | R-Series | Commercial |
| Fundus Camera | Phoenix Research Laboratories | MICRON III | |
| Tweezers Type 3 | Ted Pella, INC. | 5385-3SU | |
| 2.5% Phenylephrine | Paragon BioTeck | NDC 42702-102-15 | Ophthalmic |
| IMARIS8 | Bitplane | Version 8.1.2 | |
| ImageJ | NIH | V1.8.0_77 | |
| Hypromellose 2.5% | Goniovisc | AX0401 | Methylcellulose |
| Eye Drops (Rinse) | Bausch & Lomb | Saline Solution | |
| Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | Microscope |
| Light source | Fostec | P/N 20520 | Light source |
References
- Garoon, R. B., Stout, J. T. Update on ocular gene therapy and advances in treatment of inherited retinal diseases and exudative macular degeneration. Curr Opin Ophthalmol. 27 (3), 268-273 (2016).
- Pierce, E. A., Bennett, J. The Status of RPE65 Gene Therapy Trials: Safety and Efficacy. Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (9), a017285 (2015).
- Tolmachova, T., et al. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. J Mol Med (Berl). 91 (7), 825-837 (2013).
- Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).
- Ye, G. J., et al. Safety and Biodistribution Evaluation in Cynomolgus Macaques of rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3, a Recombinant AAV Vector for Treatment of Achromatopsia. Hum Gene Ther Clin Dev. , (2016).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLoS One. 10 (8), e0136523 (2015).
- Engelhardt, M., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of retinal pigment epithelium cells. Vis Neurosci. 29 (2), 83-93 (2012).
- Lambert, N. G., et al. Subretinal AAV2.COMP-Ang1 suppresses choroidal neovascularization and vascular endothelial growth factor in a murine model of age-related macular degeneration. Exp Eye Res. 145, 248-257 (2016).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).
- Nusinowitz, S., et al. Cortical visual function in the rd12 mouse model of Leber Congenital Amarousis (LCA) after gene replacement therapy to restore retinal function. Vision Res. 46 (22), 3926-3934 (2006).
- Huang, R., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of human retinal progenitor cells under Cyclosporin A treatment. Mol Vis. 20, 1271-1280 (2014).
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber’s congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Ridder, W. . 3. r. d., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of cataract development in anesthetized mice. Experimental Eye Research. 75 (3), 365-370 (2002).
- Ridder, W. H. 3. r. d., Nusinowitz, S. The visual evoked potential in the mouse–origins and response characteristics. Vision Res. 46 (6-7), 902-913 (2006).
- Matynia, A., et al. Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are the primary but not exclusive circuit for light aversion. Experimental Eye Research. 105, 60-69 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
