Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.
Cnidarians, en in het bijzonder Hydra, werden de eerste dieren getoond om beschadigde of doorgesneden structuren, en inderdaad dergelijke studies aantoonbaar gelanceerd moderne biologische onderzoek door het werk van Trembley meer dan 250 jaar geleden te regenereren. Momenteel de studie van regeneratie een opleving waarbij zowel "klassieke" regeneratief organismen, zoals de Hydra, planaria en Urodeles, alsook een verbreding spectrum van soorten verspreid over het gebied metazoen uit sponzen tot zoogdieren gezien. Naast haar intrinsieke belangstelling als een biologisch fenomeen, begrijpen hoe regeneratie werkt in een verscheidenheid van soorten zullen ons te informeren over de vraag of regeneratieve processen delen gemeenschappelijke kenmerken en / of soorten of context-specifieke cellulaire en moleculaire mechanismen. De starlet zeeanemoon, Nematostella vectensis, is een opkomende modelorganisme voor het regenereren. Net als Hydra, Nematostella is een lid van de oude stam, Cnidaria, maar binnen tHij klasse Anthozoa, een zuster clade de hydrozoa dat is evolutionair meer basaal. Zo aspecten van de wedergeboorte in Nematostella zal interessant zijn om te vergelijken en het contrast met die van de Hydra en andere cnidarians. In dit artikel presenteren we een methode te halveren, observeren en classificeren regeneratie van het aborale uiteinde van de Nematostella volwassene die Physa genoemd. De Physa ondergaat splijting natuurlijk als middel ongeslachtelijke voortplanting, en hetzij natuurlijke splijting of handmatig amputatie van de Physa triggers hergroei en hervorming van complexe morfologie. Hier hebben we deze eenvoudige morfologische veranderingen in een Nematostella Regeneration Staging System (de NRSS) gecodificeerd. We gebruiken de NRSS de effecten van chloroquine, een remmer van lysosomale functie blokkeert autofagie testen. De resultaten laten zien dat de regeneratie van poliep structuren, met name de mesenteria, abnormaal wanneer autofagie wordt geremd.
De waarneming van de wedergeboorte in één hydra was het rudimentaire gebeurtenis in de komst van de biologie als een experimentele wetenschap 1,2. Regeneration blijft een fenomeen van buitengewoon brede aantrekkingskracht te bioloog en leg persoon gelijk. Het potentieel voor ontwikkelingsstoornissen biologen, artsen, biomedische wetenschappers en ingenieurs weefsel te begrijpen en het overwinnen van de beperkingen op de menselijke regeneratie maakt regeneratie biologie meer dan de op zich interessant.
Nu, met het gebruik van nieuwe technologieën zoals genome sequencing en winst en verlies van functie gereedschap, het veld is klaar om uit elkaar regeneratieve mechanismen plagen en om uiteindelijk te begrijpen hoe de verschillende soorten kunnen regenereren, terwijl anderen dat niet kunnen. De mate van gemeenschappelijkheid in de moleculaire, cellulaire en morfologische reacties nog worden opgehelderd, maar tot nu toe lijkt het erop dat de fundamentele reacties onder dieren die kan regenereren meer lijkt dan zijn Imagi zou hebbenned slechts tien jaar geleden 3.
Cnidarians in het bijzonder gemakkelijk op bijna al hun lichaamsdelen regenereren midden van een breed spectrum van morfologische diversiteit. Van de eenzame zoetwater poliep, Hydra samen met de kleine mariene poliepen die immense koraalriffen te bouwen, om de complexe koloniale siphonophoren, zoals de Portugese Man-O-War, regeneratie is vaak een manier van voortplanting, in aanvulling op een mechanisme voor het repareren of de hervorming van beschadigde of verloren lichaamsdelen als gevolg van een blessure en predatie. Of de diverse soorten Cnidaria gebruiken dezelfde of verschillende mechanismen voor de regeneratie is een fundamenteel interessante vraag 4-6.
Wij, en anderen zijn het ontwikkelen van de anthozoan, Nematostella vectensis als een model voor regeneratie 7-17. We hebben onlangs ontwikkelde een staging-systeem voor het beschrijven van de regeneratie van een hele lichaam van een morfologisch uniform stukje weefsel doorsneden uit de Aboral einde van de poliep 10. Terwijl Nematostella poliepen kan regenereren wanneer doorsneden op elk niveau, hebben we gekozen om volwassenen te snijden op een aboral positie in de meest morfologisch eenvoudige regio, de Physa, mede omdat deze dicht bij de normale vlak van natuurlijke aseksueel kernsplijting 18, en ook omdat het vergunningen observatie en moleculaire analyse van hoe een hele lichaam in elkaar zetten van de eenvoudigste morfologische componenten.
De Nematostella Regeneration Staging System (NRSS) voorziet in een relatief eenvoudige set van morfologische benchmarks die kunnen worden gebruikt om de voortgang van elk aspect van de wedergeboorte scoren door een geamputeerde Physa, onder normale kweekomstandigheden of experimenteel verstoorde situaties zoals kleine molecule behandelingen, genetische manipulatie of milieu-wijziging. Zoals verwacht, is de NRSS steeds aangenomen morfologisch stellage waarop de cellulaire en moleculaire gebeurtenissen regeneratie kan worden verwezen10.
Tenslotte onze manier van snijden produceert een gapend gat verschillende ordes van grootte hoger dan de pin punt lek gebruikt in een recent onderzoek 17, maar beide wonden te helen in ongeveer 6 uur. Documenteren visueel arrestatie en verschillende fasen van wondsluiting moet voorstellen experimentele benaderingen om de schijnbare onafhankelijkheid van de grootte van een wond en de tijd die nodig is om te sluiten leggen. Zo kan een dieper visuele begrip van de aboral amputatie proces, die door dit protocol, zal verder onderzoek helpen in dit model regeneratie systeem en de toepassing van deze enscenering systeem met behulp van Nematostella vectensis verbreden.
Gebruik van Nematostella als model voor wondgenezing en regeneratie wordt steeds populairder. Aldus is het belangrijk om te kunnen de morfologische patroon van een bepaald protocol zien voordat effectieve cellulaire en moleculaire analyses kunnen worden toegewezen en vergeleken. Nematostella een hoge regeneratieve "flexibiliteit", in staat om bijna hervormen ontbrekende structuur afgezet op elke locatie, op post-planula levensstadia. Zo hebben verschillende onderzoekers onderzocht regeneratie…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door een New York Stem Cell Science (NYSTEM C028107) Subsidie voor GHT.
Nematostella vectensis, adults | Marine Biological Lab (MBL) | non-profit supplier | |
Glass Culture Dish, 250 ml | Carolina Biological Supply | 741004 | 250 ml |
Glass Culture Dish, 1,500 ml | Carolina Biological Supply | 741006 | 1,500 ml |
Polyethylene transfer pipette, 5ml | USA Scientific | 1022-2500 | narrow bore, graduated |
Polyethylene transfer pipet, tapered | Samco | 202-205 | cut off 1 inch of tip to make wide bore |
Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co. Ltd | no. 10 | blade should be curved |
#5 Dumont Fine point tweezers | Roboz | RS5045 | alternative suppliers available |
Pyrex petri dish, 100 mm diameter | Corning | 3160 | can substitute other glass petri plates |
Sterile 6 well plate | Corning Falcon | 353046 | or similar from other manufacturer |
Sterile 12 well plate | Nunc | 150628 | or similar from other manufacturer |
Sterile 24 well plate | Cellstar, Greiner bio-one | 662-160 | or similar from other manufacturer |
Brine shrimp hathery kit | San Francisco Bay; drsfostersmith.com | CD-154005 | option for growing brine shrimp |
pyrex baking dish | common in grocery stores | option for growing brine shrimp | |
artificial seawater mix 50 gal or more | Instant Ocean; drsfoster-smith.com | CD-116528 | others brands may suffice |
Plastic tub for stock ASW preparation | various | common 25 gallon plastic trash can OK | |
Polypropylene Carboy | Carolina Biological Supply | 716391 | For working stock of ASW @ 12 ppt |
Beaker, Graduated, 4,000ml | PhytoTechnology Laboratories | B199 | For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt |
Stereomicroscope and light source | various | with continuous 1 – 40x magnification |