Durchflusszytometrie-basierte Assay zur Überwachung von NK-Zell-Funktionen

Als Teil beitragen des angeborenen Immunsystems natürlichen Killerzellen (NK) in die erste Verteidigungslinie gegen virusinfizierten oder bösartig transformierten Zellen. Ein System von hemmenden und aktivierenden Rezeptoren ermöglicht es ihnen, zwischen gesunden und transformierten Zellen ohne vorherige Antigen Priming im Gegensatz zu T-Zellen zu unterscheiden. Bei der Zielzelle Begegnung lösen NK – Zellen , den Inhalt ihrer zytotoxischen Granula (zB Perforin, Granzyme) in die Immunsynapse ihr Ziel zu töten. Außerdem produzieren NK – Zellen und sekretieren verschiedene Arten von Cytokinen ( zum Beispiel Interferon γ: IFN-γ, Tumor – Nekrose – Faktor-α: TNF-α) und Chemokine ( zum Beispiel Makrophagen – Entzündungsprotein-1β: MIP-1β) , auf Zielzelle Interaktion oder Zytokinstimulation ^1.

Eine ausreichende NK-Zell-Funktionen wie Zytotoxizität, Chemokin und Zytokin-Produktion haben einen wichtigen Einfluss auf das Schicksal verschiedener diserleichtert. Leukämie – Patienten zeigen Rezidivraten erhöht , wenn sie ein defektes NK – Zell – Profil bei der Diagnose , bestehend aus reduzierten IFN-γ Produktion und eine verminderte Expression von aktivierenden NK – Zell – Rezeptoren ² aufweisen. Eine frühe Erholung der NK – Zellzahlen und Funktion einschließlich Cytokin – Produktion bei der Zielzelle Interaktion mit einem reduzierten Rückfall und eine verbesserte Überlebensrate bei Patienten mit allogener Stammzelltransplantation ³ verbunden. Außerdem können zu Beginn einer Interferon – Therapie in hepatitis C virus-infizierten Patienten die Degranulation peripherer Kapazität NK – Zellen ist stärker in frühen als Responder in Non-Responder ^4. NK – Zellzahlen (> 80 / ul) am Tag 15 nach autologer Stammzelltransplantation (autoSCT) bei Patienten mit Lymphom oder Multiplem Myelom leiden , sind prädiktiv für eine verbesserte progressionsfreie und das Gesamtüberleben ^5. In Melanom-Patienten die Expression des T-Zell-Immunglobulin und Mucin-domain-mit deg Molekül-3 (TIM-3), ein Immun-Regulationsprotein auf NK – Zellen korreliert mit dem Krankheitsstadium und Prognose ^6.

Wissenschaftler haben in den letzten Jahrzehnten NK-Zell-Funktionen überwacht. Die erste Analyse der NK – Zell – Zytotoxizität gegen Tumorzellen ohne vorherige Grundierung wurde eine ⁵¹ Cr-Freisetzungstest ⁷ angesprochen. In jüngerer Zeit entwickelte Wissenschaftler eine nicht-radioaktive Verfahren die Zytotoxizität von NK – Zellen erweitert ⁸ zu bewerten. Zytokin und Chemokin Herstellung häufig bewertet wurde ^9,10 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Techniken. Während der letzten Jahrzehnte haben sich diese Methoden durch Durchflusszytometrie basierenden Assays ergänzt. Die Verwendung von Protein – Transport – Inhibitoren (beispielsweise Brefeldin A und Monensin) und Zellpermeabilisierung Methoden in Kombination mit konventionellen Oberflächen Färbeprotokollen haben Wissenschaftler aktiviert Chemokin und Cytokin – Produktion in verschiedenen spezifischen Lymphe zu studierenocyte Teilmengen (beispielsweise T, B oder NK Zellen) ^11. Außerdem verschiedene Durchflusszytometrie basierenden Assays wurden entwickelt, T und NK-Zell-Cytotoxizität zu überwachen. 2004 Alter et al. Beschrieben , um die Oberflächenexpression des Lysosom-assoziiertes Protein CD107a (Lamp1) auf NK – Zellen auf Zielzellen – Treffen als Marker für die Degranulation von zytotoxischen Granula ^12. Da eine breite Palette von unterschiedlichen Fluorochromen und Multi-Channel-Durchflusszytometer in unseren Tagen zur Verfügung stehen, ist es möglich geworden, gleichzeitig diverse NK-Zell-Funktionen (Zytotoxizität, Zytokin und Chemokin-Produktion) in verschiedenen NK-Zell-Subpopulationen zu überwachen. Dies wird besonders wichtig in Situationen , in denen Probengröße begrenzt ist, beispielsweise in Biopsien oder Blutproben von Patienten mit Leukopenie leiden.

Um zu testen, Funktionen global NK-Zellen, die verschiedenen Durchflusszytometrie basierende Tests effizient kombiniert werden. Theorell et al. Stimulierte NK – Zellen aus HEAlthy Spender mit der Tumorzelllinie K562 und analysiert NK – Zell – Degranulation, inside-out – Signal und Chemokin – Produktion über die Durchflusszytometrie ^13. Kürzlich NK-Zell-Untergruppen, Phänotypen und Funktionen in Tumorpatienten während autoSCT wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert basierte Assays. Es konnte gezeigt werden, dass NK – Zellen in der Lage waren Zytokinen / Chemokinen auf Tumorzellerkennung in sehr frühen Zeitpunkten nach der autoSCT ¹¹ bis degranulieren und produzieren.

Hier ist ein Protokoll beschrieben NK Zellfunktionen bei Wechselwirkung mit Tumorzellen einschließlich Degranulation Kapazität, Chemokin und Cytokin-Produktion unter Verwendung einer Durchflusszytometrie-basierten Assays zu bewerten, die es möglich macht, NK-Zell-Funktionen in verschiedenen Teilmengen gleichzeitig zu überwachen.