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Rápida análise de fenótipos circadianos em Arabidopsis Protoplastos transfectadas com um relógio Reporter luminescentes

Published: September 17, 2016
doi:
10.3791/54586
,
1Institute for Molecular Plant Sciences,University of Edinburgh

Summary

O relógio circadiano regula a cerca de um terço do transcriptoma de Arabidopsis, mas a percentagem de genes que se alimentam de volta para cronometragem permanece desconhecida. Aqui nós visualizamos um método para avaliar rapidamente os fenótipos circadianos em qualquer linha mutante de Arabidopsis utilizando imagens luminescentes de um repórter circadiano transitoriamente expressa em protoplastos.

Abstract

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.

Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

Introduction

A maioria dos organismos vivos possuem uma cronometrista endógena para auxiliar negociação eficaz das variações diárias para o ambiente. Este cronometrista, o relógio circadiano, regula muitos aspectos do metabolismo e fisiologia de um organismo para antecipar as mudanças previsíveis no ambiente externo. Nas plantas, por exemplo, a antecipação de patógenos ou herbívoros ataques temporalmente previsíveis reduz fortemente a suscetibilidade geral 1-4. Metabolismo do amido é rigidamente controlado pelo relógio circadiano para garantir que as reservas de amido última até o amanhecer se crescido a longas ou curtas condições de dia 5. Na verdade, as plantas com relógios circadianos que correspondem aos ambiente mostram o aumento das taxas de crescimento de 24 hr, as taxas de fixação de carbono e as taxas de sobrevivência em comparação com plantas que executam um relógio de período incompatíveis 6. A grande influência dos ritmos circadianos em todos estes processos surge em grande medida a partir da regulação ritmada de até um terçodo transcriptoma total na Arabidopsis 7. Estes produtos de genes estão envolvidos em rítmicos uma ampla variedade de processos celulares, incluindo vias metabólicas, hormona de sinalização, e respostas de stress 7. Além disso, a regulação circadiana direta da função da proteína é estabelecido pela regulação circadiana da fosforilação 8 e, muito provavelmente outras modificações pós-traducionais (PTMs).

No centro do relógio circadiano que impulsiona essa reprogramação transcricional diária encontra-se uma rede de transcrição / feedback translacional loops (TTFLs), incluindo os genes expressos de manhã CIRCADIANO relógio associado 1 (CCA1) e tardia alongada hipocótilo (LHY) que reprimem a expressão do genes noite CALENDÁRIO dE CAB 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) e os membros do complexo à noite (CE); LUX ARRHYTHMO (LUX), floração precoce 3 (ELF3) e ELF4 9-11. sagacidade juntosh os -genes REGULADOR DE PSEUDO de resposta (PRR3, 5, 7 e 9), TOC1 reprime CCA1 expressão / LHY enquanto a CE atua como um regulador positivo 12-14. Adicional para mecanismos de feedback, pós-transcricional e pós-translacional regulação dos componentes de rede TTFL desempenha um papel importante no ritmo circadiano de ajuste. Até à data, a PTM mais abundantes em proteínas relógio circadiano é fosforilação 15. A fosforilação de CCA1 pela caseína quinase 2 (CK2) afeta a sua ligação ao alvo promotores 16 e é importante para a compensação de temperatura do relógio circadiano 17. As proteínas PRR são fosforilados diferenciada ao longo do ciclo circadiano, e fosforilação de TOC1 afeta a interação com o seu regulador negativo, o ZEITLUPE componente relógio faseada-noite (ZTL) 18. Estes exemplos ilustram como PTMs e interacções proteína-proteína sintonizar a rede TTFL em um 24-hroscilador transcricional. Para uma introdução mais detalhada para a rede relógio transcricional e de sua regulamentação, excelentes comentários recentes estão disponíveis (por exemplo, referência 15).

No entanto, o que continua a ser menos claro é a medida em que os processos regulados ritmicamente e outros aspectos do metabolismo celular de volta para alimentar o próprio mecanismo de cronometragem. rastreio extensivo de Arabidopsis mutantes quanto a defeitos de relógio pode ganhar mais compreensão de quais mecanismos ou vias de sinalização pode estar envolvida na geração de ritmos 24 hr a partir de uma rede TTFL. Para este fim, Kim e Somers publicado anteriormente um método break-through para a análise eficiente e rápida da função relógio em qualquer linha de Arabidopsis 19. Com base na utilização da expressão transitória em protoplastos, este método ultrapassa a necessidade de linhas transgénicas estáveis ​​ou cruza a linha do relógio de marcadores luminescentes. Aqui, nós visualizamos um alto isolatio protoplastos rendimentoMétodo N 20 combinado com um protocolo optimizado para rastrear defeitos circadianos por imagem luminescente de marcadores de relógio expressos transitoriamente num leitor de placas de 96 poços.

Nós vamos comparar do tipo selvagem de Arabidopsis 0 cola- se a mutantes de relógio bem caracterizados para confirmar a metodologia descrita aqui com sucesso detecta ritmos circadianos alterados. Protoplastos derivados destas linhas são transfectadas com uma construção repórter de luciferase de pirilampo que expressa a partir do promotor CCA1 circadiano; CCA1pro: 19 LUC. A luciferase catalisa a reacção de passos múltiplos em que a luciferina é convertido animado electronicamente oxiluciferina que emite luz 21, que é criada uma imagem ao longo do tempo para avaliar o período, amplitude e fase dos ritmos de transcrição nestes protoplastos.

O protocolo consiste em três partes principais; isolamento dos protoplastos, os protoplastos transfecção com o plasmídeo repórter, e im luminescenteenvelhecimento. Estas três peças devem sempre ser realizada num único dia, utilizando tampões e reagentes recém-preparados. O crescimento das plantas e a purificação de quantidades suficientes de plasmídeo repórter deve ser executada antecipadamente e não são visualizados no presente protocolo.

Protocol

NOTA: Neste protocolo, reagentes e volumes descritos são expressos por linha Arabidopsis que é testado, e resultará em seis poços replicados para que o genótipo. Multiplicar os materiais com o número de linhas a serem analisados ​​ao analisar mais do que uma linha. No vídeo, do tipo selvagem de Arabidopsis serão comparados com o relógio circadiano mutante ZTL linha (embora os resultados representativos de linhas adicionais serão fornecidos posteriormente). solução de enzima celulase 0,5% (w / v) pectinase R10 0,25% (w / v) D-manitol 400 mM CaCl2 10 mM KCl 20 mM Albumina de Soro Bovino 0,1% (w / v) MES, pH 5,7 20 mM solução W5 NaCl 150 mM CaCl2 125 mM KCl 5 mM MES, pH 5,7 2 mM Glicose 5 mM solução de MMG MES, pH 5,7 4 mM D-manitol 400 mM MgCl2 15 mM solução de PEG PEG4000 40% (w / v) D-manitol 200 mM CaCl2 </td> 100 mM solução de imagem solução W5 até ao volume final Soro fetal bovino 5% (v / v) luciferina 1,2 mm Ampicilina 50 mg / ml Tabela 1: Lista de soluções. 1. Preparação de Materiais e buffers materiais vegetais Manter Arabidopsis Col -0 sementes em água em um tubo de 1,5 ml, a 4 ° C no escuro durante quatro dias. Pipeta as sementes no solo em uma panela e transferir para condições de dia longo (16 horas de luz 8 h escuro) a 21 ° C durante 7 dias. Deixar uma tampa na panela durante os primeiros três dias para assegurar a alta humidade. Transplante de seis mudas para uma nova 8 cm x 13 cm x 5 cm panela e continuar a crescer as plantas sob as mesmas condições para another 21 dias. Verifique se o solo está úmido por toda parte. O plasmídeo repórter Purifica-se o CCA1pro: plasmídeo repórter LUC 19 a partir da cultura bacteriana previamente, usando um kit de isolamento de ADN de acordo com as instruções do fabricante. NOTA: 20 ug de plasmídeo repórter é requerida (10 ul em 2 mg / mL em dH2O) para uma transfecção. soluções NOTA: Para este protocolo são necessários cinco soluções: solução de enzima, solução de lavagem 5 (W5) solução, manitol-magnésio (MMG), polietileno glicol (PEG) de solução e solução de imagem (Tabela 1). Prepare estes antes de prosseguir para a etapa de isolamento de protoplastos. Preparar 10 ml de solução de enzima conforme a Tabela 1, a adição de enzimas anterior, e filtra-se esterilizar a solução através de um filtro de seringa de 0,22? M. Prepare as soluções restantes nos seguintes volumes: 15 ml W5 solução, 10 ml MMG solution, 1 ml de solução PEG e solução de imagem 1,5 ml conforme a Tabela 1. NOTA: É importante que a solução de PEG é não menos do que um preparado h antes da transfecção para assegurar que o PEG tem totalmente dissolvido. Filtro de esterilizar a solução de imagem através de um filtro de seringa de 0,22? M. Figura 1:. O isolamento de protoplastos As folhas de plantas de Arabidopsis adultos (A) são fixas na fita de autoclave com a camada epidérmica inferior voltada para cima (B). (C) fita mágica é suavemente pressionada contra a camada epidérmica inferior com a ponta de um tubo de 15 ml. (D) A fita mágica é removida para expor as células de mesófilo (E). (F) Tiras de fita de autoclave com licenças ligados são flutuados na solução de enzima contendo celulase e pectinase, libertando protoplastos na solução. (G) A folha esqueletos permanecem na fita de autoclave após a digestão enzimática e são descartadas, deixando os protoplastos em solução de enzima (H). Finais protoplastos mesofilo resultantes (Barra de escala = 50 mm) (I). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 2. protoplastos Isolamento Rotular uma placa de Petri e adicionar 10 ml de solução de enzima esterilizada por filtração. Fix quatro tiras de fita autoclave com o lado adesivo para cima sobre uma superfície laboratório limpo, e marcar o tamanho da placa de Petri nas tiras. Corte as folhas de 4 semanas plantas velhas (Figura 1A), e pressione a epiderme superior na fita autoclave (ou seja, a superfície epidérmica inferior voltada para cima ( <strong> Figura 1b)). Pressione suavemente as tiras de fita mágica sobre a superfície epidérmica inferior utilizando um tubo de 15 ml. Tome cuidado para não esmagar o tecido foliar (Figura 1c). Retire cuidadosamente a fita mágica fora para retirar a epiderme inferior (Figura 1d) e expor as células do mesofilo (Figura 1e). Cortar a fita de autoclave para ajustar a placa de Petri, use uma pinça para mover a fita no prato de petri e flutuar sobre a solução de enzima (Figura 1F), deixa voltado para baixo. Rodar a 60 rpm num agitador de plataforma durante 60 min, durante o qual os protoplastos será libertado para a solução. Use uma pinça para remover e descartar as tiras de fita autoclave (Figura 1 g) e pipeta a solução contendo os protoplastos (Figura 1h) em um tubo de 50 ml. Use uma ponteira de grande calibre (como uma dica P5000 ou uma dica P1000 com o fim cortadas). Centrifugar os protoplastos em 100 xg durante 3 min a 4 ° C e remove-se o sobrenadante com uma pipeta. Tome cuidado, pois o pellet é muito solto. Adicionar solução W5 10 ml aos protoplastos e ressuspender suavemente agitando o tubo. Descanse os protoplastos em gelo durante 30-60 minutos. Durante esta etapa, avaliar um rendimento de protoplastos por contagem num hemocitómetro (Figura 1-I). Recolher os protoplastos por centrifugação a 100 x g durante 3 min a 4 ° C e remove-se o sobrenadante com uma pipeta. Tome cuidado, pois o pellet é muito solto. Ressuspender as protoplastos para uma concentração de 5 x 10 5 protoplastos / ml em solução MMG. 3. protoplastos transfecção Adicionar 10 ul de plasmídeo repórter (2 ug / uL) para um tubo de 15 ml. Adicionar 400 uL de protoplastos para o tubo. Adicionar um volume (410 mL) solução de PEG e misture invertendo suavemente o tubo 12 vezes para transfectar os protoplastos. Após 8-15 min incubation à temperatura ambiente, diluir a mistura de protoplastos-ADN-PEG com quatro volumes (1640 uL) solução W5 e misturar por inversão suave seis vezes. Recolher os protoplastos transfectados por centrifugação a 100 xg durante 2 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante com uma pipeta. Mais uma vez, tome cuidado, pois o pellet é muito solto. Ressuspender os protoplastos em solução de imagem ul 1.250. Alíquota de 200 ul em seis cavidades replicadas de uma placa de 96 poços, preencher quaisquer vazios poços com solução W5, e selar a placa com uma tampa transparente adesivo adequado para imagiologia luminescente. 4. Criação de Imagens Transferir a placa para qualquer configuração de imagem luminescente adequado para imagens de plantas. Mudar as tampas adesivas sobre as placas 10-15 minutos após a transferência para evitar diferenças de condensação e de pressão entre os poços, em seguida, começar de imagem. Ler a placa a cada ~ 45 min (3 s por poço) durante cinco dias à temperatura ambiente. Note ofrequência da placa lê e o tempo de leitura por poço pode variar dependendo da estrutura de imagem. Análise 5. Os dados Analisar os resultados de luminescência usando qualquer software de análise (por exemplo, Biological Rhythms Analysis System Software (BRONZE) 22). Compare a linha mutante para controles do tipo selvagem para revelar defeitos circadianos.

Representative Results

Os protoplastos de Arabidopsis de tipo selvagem foram comparadas com os mutantes de relógio conhecidos CCA1 / LHY (período curto mutante 2), ZTL (período longo mutante 23), e a linha a superexpressão CCA1 OX (arrítmicos 24). Todos foram transientemente transfectadas com o CCA1pro: repórter LUC e fotografada em luz constante num leitor de placas durante 5 dias. Aqui mostramos que no mutante CCA1 / LHY, o período de funcionamento livre da expressão do gene circadiano-controlada é reduzido (Figura 2a), em linha com o período de publicada analisados ​​por expressão transgénica estável de relógio marcadores luminescentes 2,9. O período de oscilações circadianos em protoplastos do mutante ZTL é mais longo do que no tipo selvagem (Figura 2b), de acordo com resultados previamente publicados de mudas, suspensão de células cultures e protoplastos 19,23,25. Superexpressão de CCA1 bloqueia o relógio na manhã de fase e transcrição global se torna arrítmico 24. Consistentemente, não observamos oscilações na CCA1pro: Expressão LUC em protoplastos -oX CCA1 (Figura 2c). Figura 2: protoplastos ritmos circadianos Protoplastos de Col- 0, CCA1 / lhy, ZTL e CCA1 OX foram transitoriamente transformada com o CCA1pro: LUC construir e ritmos circadianos em luminescência foram fotografadas ao longo de 5 dias (A – C). (D) as estimativas de período circadiano com base em traços de luminescência em Col -0, CCA1 / lhy e ZTL (A – B). Euum ± SEM, n = 3-5, t-teste p-valor, conforme indicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Genótipo Período (protoplastos) Período (transgênico) Reportado por: Referências col- 0 23,0 ± 0,21 24,4 ± 0,09 pCCA1: LUC em Col -0 (2) CCA1 / lhy 20,6 ± 0,13 19,9 ± 0,11 pCCA1: LUC em Col -0 (2) ~ 18 RNA em G fundo er (9) <td> ZTL 25,1 ± 0,12 27,4 ± 0,5 CAB2: LUC em C24 ecotype (22) CCA1 OX arrítmico arrítmico pCCA1: LUC (dados LD apenas) (2) arrítmico RNA e proteína na Col -0 fundo (23) Tabela 2: ritmos circadianos em protoplastos comparação com transgênicos Mudas O período circadiano da pCCA1:. Expressão LUC em protoplastos comparação com os comprimentos período relatados pela primeira vez para a mutação e, se disponível, com pCCA1: Expressão LUC em Col -0.

Discussion

Aqui, apresentamos um ensaio rápido para rastrear defeitos período circadianos em linhas de Arabidopsis, incluindo o isolamento de protoplastos, transfecção, e imagiologia luminecent. O período circadiano no tipo selvagem Arabidopsis eo relógio mutantes CCA1 / lhy, ZTL e CCA1 OX foi calculado a partir de medições de luminescência de um CCA1pro: Repórter da LUC e verificou-se ser consistente com os dados publicados gerados a partir de plantas inteiras usando mais tempo- consumindo abordagens transgénicas (Tabela 2). Utilizando este ensaio para rastrear os mutantes de Arabidopsis evita o requisito inicial para gerar linhas transgénicas luminescentes, que é demorado e apenas pode mostrar que um mutante particular, exibe ritmos de tipo selvagem. Uma clara vantagem deste protocolo é que qualquer linha de Arabidopsis podem ser rastreados em curto espaço de tempo para os ritmos circadianos alterados de transcrição, o que ajudará a identificação de mais genes que afetam a cronometragem em plantas.

<p class= "Jove_content"> Isolamento de protoplastos pode ser trabalhoso, especialmente se a linha mutante exibe um fenótipo anão. Métodos descritos anteriormente para gerar protoplastos envolvem o corte ou folhas de plântulas em tiras finas e de vácuo que se infiltram as tiras com solução de enzima para permitir que os enzimas para atingir as paredes celulares 26,27. A digestão subsequente requer, pelo menos, 3 horas de incubação no escuro a libertar os protoplastos para a solução de enzima. Quando infiltração por vácuo não é aplicada, tempo de incubação até 18 horas é recomendado. No protocolo aqui apresentado, infiltração por vácuo é desnecessário porque a camada de células epidérmicas impenetrável para as enzimas é removida pela fita adesiva. Ao gerar protoplastos cortando material vegetal é necessário protoplastos separar os restos da parede celular após a digestão; Isto é feito tipicamente por filtração da solução ou purificando-o em um gradiente de açúcar 27,26. Aqui, qualquer tecido não digerido permanecerá na fita autoclave depoisdigestão, assim filtração e purificação com gradiente de açúcar dos protoplastos pode ser omitido. Há uma chance de que o estresse resultante de procedimentos protoplasting prolongados afeta a viabilidade celular eo relógio circadiano. O método protoplasting baseado em fita 20 visualizados aqui produz um elevado número de protoplastos; e determinado a viabilidade das células ao longo de uma série de tempo circadiano e os comprimentos correspondentes período de protoplastos e plantas inteiras (Tabela 2), a metodologia aqui descrita é preferido em relação aos métodos alternativos para gerar protoplastos.

A etapa de transfecção do protocolo é um passo crítico que os impactos sobre a viabilidade dos protoplastos. A solução de PEG permite que o ADN a ser emitido para dentro da célula, e o tempo de incubação nesta solução (passo 3.4) e a percentagem de PEG deve ser determinada empiricamente. A concentração do padrão é de 20%, com concentrações mais baixas reduzem a eficiência de transformação e maiorconcentrações reduzindo a viabilidade 28. O tempo de incubação tão curto quanto cinco minutos poderia render transfecção eficiente dos protoplastos 27.

Os protoplastos podem ser visualizados em qualquer plataforma de imagem luminescente. Neste vídeo, utilizou-se um leitor de placas de luminescência equipado com luzes externas (vermelho e azul, os LEDs 630 e 470 nm, respectivamente, a uma intensidade combinada de ~ 20 μE), que permite a pesquisa de alto rendimento e medições frequentes. Outros equipamentos de imagem que detecta luminescência, tais como leitores de placas ou configurações alternativas com base em torno de um dispositivo (CCD) de acoplamento de carga, pode ser aplicado igualmente bem, desde que a iluminação está disponível para a fotossíntese. A vantagem de utilizar uma câmara CCD montada num armário controlável é que a luz e temperatura podem ser programados. Uma desvantagem é o tempo de captura mais tempo, a introdução de períodos prolongados de escuridão que podem causar estresse aos protoplastos, além de perturbaring cronometragem endógeno. Independentemente de qual plataforma experimental é escolhido, o ajuste de configurações é provável que seja necessário em comparação com configurações para mudas ou plantas maduras. Em nossa experiência, aumentando as concentrações de plasmídeo repórter durante a transfecção e / ou luciferina no buffer de imagens pode resolver todos os ritmos irregulares ou rapidamente de amortecimento que podem ocorrer em experimentos iniciais.

Em experiências subsequentes, a metodologia descrita aqui pode ser aplicado para estudar o fenótipo circadiano de qualquer linha de Arabidopsis mutantes. Com pequenas modificações, por exemplo, o efeito de várias drogas na cronometragem pode ser estudada nesta configuração. Além disso, a transfecção pode ser modificado para incluir microARN artificial para silenciamento de genes 19, expandir ainda mais a versatilidade do presente protocolo. Protocolos para gerar protoplastos de arroz são bem estabelecida 29 e o protocolo de imagem aqui apresentada poderia igualmente ser aplicada para promover nossa understanding do relógio na economicamente importantes plantas cultivadas monocotiledôneas.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).

Materials

CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride  Merck Millipore 219466
Pectinase R10 Sigma Aldrich P2401
D-mannitol Sigma Aldrich M4125 
CaCl2 Sigma Aldrich C4901
KCl Sigma Aldrich P3911
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A4503
MES Acros Organics 327765000
NaCl Acros Organics 327300010
Glucose Fischer Scientific G/0500/60
MgCl2 Sigma Aldrich M2670
Polyethylene glycol (PEG) 4000 Acros Organics 434630010
Fetal Bovine Serum  Sigma Aldrich F4135
D-Luciferin, Firefly Biosynth AG L-8200 Dissolve luciferin powder in 0.1M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50mM
Ampicillin Sigma Aldrich A9618
Comply Steam Indicator Tape 3M 1222
Magic Tape 3M 819-1460
Petri Dishes Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Microplate, 96 well, flat bottom, white Greiner Bio-One 655075
TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates Perkin Elmer 6050195
Syringe, 10 ml, w/o needle BD Plastipak 302188
Syringe filter 0.22 µm Merck Millipore SLGP033RS
Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS) Free download at amillar.org
QIAfilter Maxiprep Kit Qiagen 12262
Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell Hawksley AC6000
Bright field microscope Optika Microscopes B-150POL-B
LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module Berthold Technologies Ltd 57947/57948
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References

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Hansen, L. L., van Ooijen, G. Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter. J. Vis. Exp. (115), e54586, doi:10.3791/54586 (2016).
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