Capillaire elektroforese Monitor Peptide Enten op chitosan films in Real Time

Vrije oplossing capillaire elektroforese (CE) is een techniek die verbindingen in oplossingen op basis van hun lading naar wrijvingsgetal ^1,2 scheidt. Charge-gewicht verhouding wordt vaak genoemd in de literatuur, maar deze vereenvoudiging geldt niet polyelektrolyten, waaronder polypeptiden in dit werk, en bleek ook niet geschikt voor kleine organische moleculen ³ te zijn. CE verschilt van andere scheidingstechnieken, dat het geen stationaire fase slechts achtergrondelektrolyt (gewoonlijk een buffer) hebben. Hierdoor kan de techniek robuust zijn vermogen om een groot aantal monsters analyseren complexe matrices ⁴ zoals plantaardige vezels ^5, fermentatie brouwsels ⁶ enting op synthetische polymeren ^7, voedselsteekproeven ^8, en nauwelijks oplosbare peptiden ⁹ zonder vervelende monstervoorbereiding en zijn zuivering. Dit is vooral van belang voor complexe polyelektrolyten die ontbinding kwesties (such als chitosan ¹⁰ en gellangom ¹¹⁾ en daarom bestaan als geaggregeerde of neergeslagen in oplossing en zijn met succes geanalyseerd zonder monster filtratie. Verder is de analyse van suikers in ontbijtgranen was het injecteren van monsters met deeltjes van granen monsters b geprecipiteerd in water ^8. Dit geldt ook voor de analyse van vertakte polyelektrolyten of copolymeren ^12,13. Uitgebreid werk is ook bij de ontwikkeling van technieken CE specifiek voor de analyse van eiwitten voor proteomics ^14, chirale scheiding van natuurlijke of synthetische peptiden ¹⁵ en microchip scheidingen van eiwitten en peptiden ¹⁶ afgerond. Aangezien de scheiding en analyse plaatsvinden in een capillair worden slechts kleine hoeveelheden monster en oplosmiddelen die CE mogelijk maakt een lagere operationele kosten dan andere scheidingstechnieken zoals chromatografie ^5,6,17 hebben. Aangezien de scheiding door CE is snel, kan de monitoring van de reactie kinetiek. Dit werd aangetoond bij het enten van peptiden op chitosan films voor betere celadhesie ^18.

Chitosan is een polysaccharide afgeleid van de N -deacetylation chitine. Chitosan films kunnen gebruikt worden voor verschillende biomedische toepassingen zoals biologische hechtmiddelen ¹⁹ en celgroei substraten ^18,20, vanwege chitosan van ²¹ biocompatibiliteit. Celhechting specifieke extracellulaire matrixeiwitten zoals fibronectine, collageen en laminine, is direct verbonden met de overleving van de cellen ^22. Met name verschillende celtypen vereisen vaak hechting aan verschillende extracellulaire matrixeiwitten op overleving en goede werking. Celhechting chitosan films bleek worden verbeterd door het enten van ²³ fibronectine; Echter, de voorbereiding, zuivering en enten van dergelijke grote eiwitten is economisch niet haalbaar. Afwisselend een reeks van kleine peptiden have aangetoond kunnen de eigenschappen van grote extracellulaire matrixeiwitten nabootsen. Bijvoorbeeld, peptiden zoals fibronectine mimetica RGD (arginine – glycine – asparaginezuur) en RGDS (arginine – glycine – asparaginezuur – serine) zijn gebruikt om vergemakkelijken en celhechting ^24. Covalent enten van RGDS op chitosan films resulteerde in een verbeterde celbinding op cellen bekend te hechten aan fibronectine in vivo ^18. Substitueren grotere eiwitten vindt fibronectine met kleinere peptiden die dezelfde functionaliteit levert een aanzienlijke kostenreductie.

Hier peptide enten chitosan werd uitgevoerd zoals eerder gepubliceerd ^18. Zoals eerder aangetoond, deze aanpak levert eenvoudige en efficiënte enting met de koppelingsmiddelen EDC-HCI (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) en NHS (N-hydroxysuccinimide) om het carbonzuur van de RGDS te functionaliseren geënt op dechitosan film. Twee voordelen van deze enten methode zijn dat zij geen wijziging van de chitosan of van het peptide vereist, en wordt uitgevoerd in waterig medium compatibiliteit met toekomstige celcultuurtoepassingen ^18,20 maximaliseren. Als de koppelingsmiddelen en het peptide kan worden opgeladen, CE is een geschikte methode voor de analyse van de reactiekinetiek. Belangrijker analyse van de reactiekinetiek via CE maakt real-time monitoring van de entreactie, en dus stelt beide optimaliseren en te kwantificeren van de mate van enten.

Hoewel het niet routinematig nodig kan de resultaten van de CE analyse gevalideerd off-line door een directe meting van het peptide enting op het chitosan films via solid-state NMR (kernspinresonantie) spectroscopie ^25,26 aan de covalente enten tonen van het peptide op de film ^18. Vergeleken met solid-state NMR spectroscopie, de real-time analyse doorCE maakt de kwantificering van het peptide in realtime en dus in staat zijn de kinetica van de reactie te evalueren.

Bovenstaande werkwijze is eenvoudig en maakt het real-time analyse van peptide enting op chitosan films indirecte kwantificering van de omvang van de enten. De aangetoonde werkwijze kan worden uitgebreid tot de real time kwantitatieve evaluatie van verschillende chemische reacties zolang de reactanten of de produkten worden onderzocht kunnen worden gebracht.