Summary

Un metodo non invasivo e tecnicamente non intensiva per l'induzione e Fenotipizzazione Sperimentale polmonite batterica nei topi

Published: September 28, 2016
doi:

Summary

Diversi metodi sono stati descritti in letteratura per modellare la polmonite batterica nei topi. Qui, descriviamo un non invasivo, economico, rapido metodo per indurre la polmonite tramite aspirazione (vale a dire, l'inalazione) di un inoculo batterico pipettati in orofaringe. metodi di valle per la valutazione della risposta immunitaria innata polmonare sono anche dettagliata.

Abstract

Anche se polmonite acquisita in comunità rimane un importante problema di salute pubblica, modelli murini di polmonite batterica hanno recentemente facilitato significativi progressi preclinici nella nostra comprensione della patogenesi cellulare e molecolare di base. In vivo modelli murini catturare la fisiologia integrata e la resilienza della risposta di difesa ospitante un modo non rivela, ex vivo approcci semplificati alternativi. Diversi metodi sono stati descritti in letteratura per l'inoculazione intrapolmonare di batteri nei topi, compresi aerosolizzazione, consegna intranasale, perorale cannulazione endotracheale in condizioni 'ciechi' e visualizzate, e transcutanea cannulazione endotracheale. Tutti i metodi hanno meriti relativi e limitazioni. Qui, descriviamo in dettaglio un metodo non invasivo, tecnicamente non intensivo, poco costoso, e rapido per la consegna intratracheale di batteri che coinvolge l'aspirazione (cioè, inalazione) per il mousedi un inoculo infettiva pipettati in orofaringe, mentre in anestesia generale. Questo metodo può essere utilizzato per la consegna polmonare di un'ampia varietà di agenti biologici e chimici non corrosivi, ed è relativamente facile da imparare, anche per laboratori con minima esperienza precedente con procedure polmonari. Oltre a descrivere il metodo di polmonite ab ingestis, forniamo anche procedure passo-passo per saggiare la successiva in vivo polmonare risposta immunitaria innata del mouse, in particolare, i metodi per quantificare la clearance batterica e la risposta immunitaria cellulare delle vie aeree infetto. Questo approccio integrato e semplice valutazione polmonite consente di valutazione rapida e robusta dell'effetto delle manipolazioni genetiche e ambientali upon polmonare immunità innata.

Introduction

Polmonite acquisita in comunità rimane la principale causa di morte per infezioni negli Stati Uniti, con poca variazione complessiva dei tassi di mortalità nel corso degli ultimi 40 anni, nonostante i miglioramenti nella vaccinazione e le strategie di antibiotici 1,2. Nonostante la mancanza di progressi sensibili a livello della salute pubblica, in anni recenti progressi drammatici sono stati fatti nella comprensione della patogenesi molecolare e cellulare di polmonite, con molti di questi passi avanti reso possibile dall'utilizzo di modelli murini di infezione polmonare. La trattabilità genetica del topo, la somiglianza del murino e sistema immunitario umano, e la vasta gamma di reagenti immunologici murini mirati che si sono resi disponibili in commercio hanno facilitato insieme rapido progresso del campo.

modelli murini di polmonite batterica descritti in letteratura sono generalmente invocato uno dei quattro percorsi tecnici per l'inoculazione dei patogeni: i) aerosol; ii) intrconsegna Anasal; iii) la consegna per via orale; e iv) iniezione intratracheale chirurgica (cioè, tracheotomia) 3. Tutte le vie di infezione presentano vantaggi e svantaggi 3. In particolare, l'esposizione relativa delle vie aeree superiori, possibilità di mescolanza di flora oronasali, i requisiti per l'anestesia generale, la variabilità della inoculo consegnato al polmone distale, la distribuzione lobare dei patogeni consegnati, i requisiti di perizia tecnica, e la morbilità procedurali variano ampiamente tra questi approcci.

Comunemente tecniche di infezione orale per utilizzati includono incannulamento endotracheale (translaringea) sia tramite un approccio 'blind' (non visualizzato), o sotto la visualizzazione della laringe diretta 3-5. Entrambi i metodi, mentre robusti, richiedono una formazione sostanziale e portano anche il rischio di traumi per le vie aeree superiori. Nella presente relazione, si descrive un metodo tecnicamente non intensivo, non invasivo, economico, e la rapida delle infezioni per via orale, wdichiara batteri Klebsiella pneumoniae (nell'esempio fornito) pipettati in orofaringe di un mouse anestetizzato vengono consegnati ai polmoni tramite aspirazione (vale a dire, per inalazione). Noi e altri abbiamo utilizzato la tecnica polmonite ab ingestis successo 6-9. Questo metodo polmone recapito versatile e di facile apprendimento può essere esteso alla consegna di molti agenti non corrosivi aggiuntivi ai polmoni, quali citochine e altre proteine, molecole associati ai patogeni (ad esempio, lipopolisaccaride), cellule (cioè, trasferimento adottivo), e le tossine (ad esempio, bleomicina). Oltre a discutere importanti considerazioni tecniche, abbiamo anche descriviamo un approccio integrato, quantitativa per valutare la successiva risposta dell'ospite alla polmonite, compresa la misurazione a valle della clearance batterica (ad esempio, unità formanti colonia [CFU] quantificazione negli organi polmone e periferici) e dei leucociti accumulo nello spazio aereo.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la legge sul benessere degli animali e la politica US Public Health Service su Humane cura e l'uso di animali da laboratorio dopo la revisione dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo del NIEHS. 1. Preparazione di K. Cultura pneumoniae Attenzione: eseguire tutti i passaggi del 2 (BSL2) cappuccio o altra area designata BSL2 livello di biosicurezza e gettare i rifiuti secondo l…

Representative Results

C57BL / 6 topi sono stati infettati con 2.000 UFC di K. pneumoniae 43816 (sierotipo 2) tramite aspirazione orofaringea nei polmoni. A questa dose, i topi di solito iniziano a mostrare sintomi clinici dopo l'infezione 12-24 ore tra cui letargia, pelliccia arruffata, e perdita di peso del 5-10% (Figura 2A). All'interno di post-infezione 48-72 ore, molti dei topi mostrano sintomi della malattia e morbilità che in genere viene preceduto da una media di perd…

Discussion

Modelli murini di polmonite batterica, collaborato con gene targeting e negli interventi biologiche e farmacologiche in vivo, hanno fornito spunti critici nella risposta difesa ospite polmonare. Grandi progressi sono stati fatti, in particolare, nella nostra comprensione delle chemochine e molecole di adesione che regolano il reclutamento dei neutrofili allo spazio aereo infetto 10,11. Modelli in vivo di polmonite, a differenza di approcci basati su celle o alternativi, hanno anche …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported in part by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (Z01 ES102005).

Materials

Klebsiella pneumoniae, serotype 2 ATCC 43816
Tryptic soy broth Becton Dickenson 211825
Excel Safelet IV Catheters, 18G x 1 1/4" Claflin Medical Equipment MEDC-031122
Hema 3 Solution 1 Fisher 23-122-937
Hema 3 Solution 2 Fisher 23-122-952
Hema 3 Fixative Fisher 23-122-929
27½ gauge tuberculin syringes Fisher 14-826-87
Lithium heparin plasma collectors Fisher 2675187
L-shaped disposable spreaders Lab Scientific DSC
1x PBS, pH 7.4 prepared in-house n/a Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)   
ACK lysis buffer prepared in-house n/a NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4

References

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Cite This Article
Madenspacher, J. H., Fessler, M. B. A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice. J. Vis. Exp. (115), e54508, doi:10.3791/54508 (2016).

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