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Bioengineering

Fabricando degradáveis hidrogel de Thermoresponsive em várias escalas de comprimento através da extrusão reativa, microfluídica, auto-montagem e eletrofiação

Published: April 16, 2018
doi:
10.3791/54502
, , , , ,
1Department of Chemical Engineering,McMaster University

Summary

Os protocolos são descritos para a fabricação de hidrogel degradáveis thermoresponsive baseado no hidrazona cross-linking de oligômeros polímeros na escala a granel, microescala e escala nanométrica, último para preparação do gel de nanopartículas e nanofibras.

Abstract

Enquanto vários materiais inteligentes tem sido explorados para uma variedade de aplicações biomédicas (por exemplo, entrega de drogas, engenharia de tecidos, bioimaging, etc.), seu último uso clínico tem sido dificultado pela falta de biologicamente relevantes degradação observada para materiais mais inteligentes. Isto é particularmente verdadeiro para temperatura-responsivo hidrogel, que é quase uniformemente à base de polímeros que são funcionalmente não-degradáveis (por exemplo, poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) ou poli (metacrilato de glicol oligoethylene) (POEGMA) ). Como tal, para traduzir efetivamente o potencial de hidrogel de thermoresponsive para os desafios de entrega de medicamento telecomandado ou metabolismo-regulado, andaimes com interações de material de células ajustáveis, materiais de theranostic com o potencial da pilha para imagens e entrega da droga e outros tais aplicativos, um método é necessário para processar o hidrogel (se não totalmente degradáveis) pelo menos capaz de afastamento renal após o necessário tempo de vida do material. Para o efeito, este protocolo descreve a preparação do hidrogel hydrolytically degradáveis hidrazona-quitosana em várias escalas de comprimento, baseadas na reação entre maleica e aldeído-acrescida de oligómeros PNIPAM ou POEGMA com molecular pesos abaixo do limite de filtração renal. Especificamente, os métodos para fabricar thermoresponsive degradáveis granel hidrogel (usando uma técnica de seringa de cano duplo), partículas de hidrogel (em ambos a microescala através da utilização de uma plataforma de microfluídica, facilitando a mistura simultânea e emulsificação de polímeros o precursor e a nanoescala através do uso de um termicamente orientado auto-montagem e método de cross-linking), e nanofibras de hidrogel (usando uma estratégia reativa eletrofiação) são descritas. Em cada caso, hidrogel com temperatura-responsivo propriedades semelhantes aos obtidos através do convencional radical livre do cross-linking processos pode ser alcançados, mas a rede reticulado hidrazona pode ser degradada ao longo do tempo para re-formar o oligoméricas polímeros de precursor e habilitar autorização. Como tal, esperamos que esses métodos (que pode ser aplicado genericamente para qualquer sintético polímero solúvel em água, não só inteligente materiais) irão permitir mais fácil tradução de materiais sintéticos de inteligentes para aplicações clínicas.

Introduction

Materiais inteligentes têm atraído atenção significativa devido ao seu potencial para reversíveis “on-demand” respostas aos sinais externos e/ou ambientais. Temperatura-responsivo materiais têm atraído interesse particular devido ao seu comportamento de temperatura (LCST) solução crítica inferior, resultando na precipitação temperatura-conduzido em temperaturas T > LCST1,2. No contexto de hidrogel de thermoresponsive, esse comportamento de temperatura crítica da solução inferior é manifestado por reversíveis inchaço/de-swelling eventos que resultam em tamanhos de temperatura-sintonizável em massa (maior no T < LCST)3, o tamanho dos poros (maior em T < LCST)4e propriedades interfaciais (mais hidrofílico na T < LCST)5. Essas transições foram aplicadas extensamente na entrega da droga (para drogas externas ou ambientalmente-triggerable versão4,6,7), engenharia e célula de cultura de tecidos (para a aderência de célula thermoreversible / delaminação8,9,10), separações (para porosidades de membrana comutável e permeabilidades ou termicamente recicláveis diagnóstico suporta11,12, 13), processos de microfluidic (para válvulas on-off regulação fluxo14,15) e modificadores reológicos (para viscosidades temperatura ajustável16). O mais comumente investigados thermoresponsive hidrogel baseiam-se em poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)17, embora o trabalho significativo (e crescente) também tem sido conduzido na poli (metacrilato de glicol oligoethylene) (POEGMA)2 ,18 e poly(vinylcaprolactam) (PVCL)19,20. POEGMA tem atraído particular interesse recente, dada sua biocompatibilidade melhorada antecipado21,22e seu comportamento LCST de fácil-para-melodia, no quais as misturas linearmente previsível de monômeros com diferentes números de unidades de repetição de óxido de etileno em suas cadeias laterais podem alterar a LCST de ~ 20 ° C a > 90 ° C2,23. No entanto, cada um destes polímeros é preparado pela polimerização do radical livre e, portanto, contém um backbone de carbono-carbono, limitando significativamente o potencial utilitário e Traduzibilidade próprios de tais polímeros no contexto das aplicações biomédicas em que degradação (ou pelo menos a capacidade de compensação através de filtração renal) normalmente é uma exigência.

Em resposta a esta limitação, temos recentemente relatado extensivamente sobre a aplicação da química hidrazona (i. e., a reação entre maleica e aldeído-acrescida de pré-polímeros) para preparar degradáveis análogos thermoresponsive hidrogel24,25,26,,27,28,29. A reação rápida e reversível entre grupos maleica e aldeído após mistura dos polímeros funcionalizados precursor30 permite ambos gelificação em situ (permitindo injeção superficial destes materiais sem a necessidade de cirurgia implantação ou qualquer tipo de estímulo externo de polimerização como iniciação de irradiação ou produto químico UV) bem como degradação hidrolítica da rede a uma taxa controlada pela química e densidade dos sites de reticulação. Além disso, ao manter o peso molecular dos pre-polímeros usado para preparar o hidrogel abaixo do limite de filtração renal, hidrogel feito usando esta abordagem degrada volta para os polímeros oligoméricas precursor que podem ser apagados do corpo25 de27, ,28. Juntamente com a baixa citotoxicidade e resposta baixo tecido inflamatório induzido por estes materiais25,26,27, esta abordagem oferece um método potencialmente pode ser convertido para o uso de thermoresponsive hidrogel inteligente na medicina, particularmente se bem controlados análogos degradable tal hidrogel em todas as escalas de comprimento (granel, micro e nano) podem ser fabricados.

Neste protocolo, descrevemos os métodos para fazer thermoresponsive sintético pré-polímeros acrescidos com números controlados de maleica e grupos aldeído bem como métodos para aplicar estes polímeros para criar hidrogel com dimensões bem definidas na várias escalas de comprimento. Em particular, este manuscrito descreve quatro abordagens distintas temos desenvolvido para controlar a mistura do reativa maleica e aldeído-acrescida de pré-polímeros e, assim, criar thermoresponsive redes de hidrogel com geometrias bem definidas e morfologias:

Para criar massa degradáveis hidrogel com tamanhos definidos, uma estratégia de modelagem é descrita pelo qual os reativos pré-polímeros são carregados em barris separadas de uma seringa de cano duplo equipado à saída com um misturador de estática e posteriormente coextrudadas em um molde de silicone com o hidrogel desejada forma e dimensões21,27 (Figura 1).

Figure 1
Figura 1 : Esquemática da formação de hidrogel granel. Maleica e soluções de polímero acrescida de aldeído (em água ou tampão aquosa) são carregadas em barris separadas de uma seringa de cano duplo e então Co-extrudado através de um misturador estático em um molde cilíndrico de silicone. Rápida em situ gelificação mediante mistura formas um hidrazona hidrogel de quitosana, que é livre de pé (uma vez que o molde é removido) dentro de segundos a minutos, dependendo da concentração e grupo funcional de densidade dos polímeros precursor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para criar partículas de gel de degradável na escala mícron, um método de microfluídica reativa é descrito na qual precursor soluções de polímero são simultaneamente misturados e emulsionado usando um projeto de microplaqueta microfluidic litografia-modelado suave, permitindo que o formação de gotículas de polímero reativo misto que posteriormente gel em situ a forma gel de micropartículas com tamanhos modelados pela emulsão (Figura 2)31,32.

Figure 2
Figura 2 : Esquemática da formação de micropartículas gel através de microfluídica reativa. (A, B) Maleica e soluções de polímero acrescida de aldeído (em água ou tampão aquosa) são alimentadas por bomba de seringa em reservatórios separados conectados a jusante através de uma série de zig-zag de canais projetado para criar um gradiente de pressão, impedindo o refluxo. Os polímeros são, em seguida, misturados, pouco antes de ser cortado pelo óleo de parafina, fluindo de ambos os lados (também impulsionados por uma bomba de seringa) e forçados através de um bocal, resultando na produção de fluxo-foco de aquosa gotas (solução de polímero), em uma fase de óleo de parafina contínua (Veja uma ilustração da área do bocal e o processo de formação da gota (B)). Um adicional duas entradas de óleo de parafina são posicionados após o bico para mais separado as gotas no canal coleção para permitir a gelificação completa antes da remoção de partículas do fluxo laminar, após o qual o microparticulate resultante geles são coletados num copo magneticamente mexido; (C) imagens do processo de geração da gota para o bocal (note que esse polímero maleica é rotulado como azul para ilustrar a mistura)

Para criar partículas de gel de degradável na escala nanométrica, um termicamente controlado por reativa auto-montagem método é descrito em que uma solução de um dos polímeros reativa precursor (o polímero “semente”) é aquecida acima de sua LCST para formar um nanoaggregate estável que é quitosana posteriormente pela adição do polímero precursor reativa complementares (o polímero “reticulação”); o nanogel de quitosana hidrazona resultante tem um tamanho modelo diretamente, o nanoaggregate (Figura 3)28.

Figure 3
Figura 3 : Esquemático da formação nanogel através de orientado termicamente reativa auto-montagem. Solução aquosa contendo o polímero maleica-acrescida de (thermoresponsive) é aquecida acima de sua mais baixa temperatura crítica solução para criar um nanoaggregate de filmes estável. A seguir, um polímero de aldeído-acrescida é adicionado ao crosslink o nanoaggregate através da formação de hidrazona vínculo e assim estabilizar a partícula nanogel em cima de refrigerar abaixo a LCST. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para criar nanofibras degradáveis, uma técnica reativa eletrofiação é descrita no qual uma seringa de cano duplo, equipada com um misturador de estática à saída (como usado para fazer massa hidrogel) é anexada a uma plataforma de padrão eletrofiação (Figura 4 )33.

Figure 4
Figura 4 : Esquemática da formação de nanofibras hidrogel através de eletrofiação reativa. Uma seringa de cano duplo com um misturador estático (carregado conforme descrito por hidrogel em massa, mas também incluindo uma fração de alto peso molecular poly(ethylene oxide) como eletrofiação ajuda) é montada em uma bomba de seringa, com a agulha na extremidade da seringa conectada para uma fonte de alimentação de alta tensão. Hidrazona reticulação ocorre durante a fibra girando o processo, para que quando o fluxo atinge o coletor (folha de alumínio ou um disco rotativo de alumínio) a morfologia nanofibrous é mantida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A aplicação de tais métodos para a criação de redes de hidrogel inteligente degradável é demonstrada no presente protocolo usando PNIPAM ou POEGMA como o polímero de interesse; no entanto, as abordagens básicas descritas podem ser traduzidas para qualquer polímero solúvel em água, embora com ajustamentos adequados para viscosidade e (no caso da auto-montagem nanogel método de fabricação) a estabilidade do pré-polímero na formação da semente nanoaggregate.

Protocol

1. síntese de polímeros maleica-acrescida Nota: A seguinte receita específica é fornecida para o PNIPAM-mimética polímero precursor do thermoresponsive POEGMA (PO10) com 30 functionalization de maleica mol %. Polímeros de precursor PNIPAM e POEGMA com temperaturas de transição de fase diferentes podem ser preparados usando esse mesmo método geral mas modificar o tipo e a proporção dos monômeros do núcleo usado (veja a seção 1.2 para modificações para diversos polímeros POEGMA)21 , 25 , 27. Pesar 37 mg de 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe, iniciador), 3,1 g de metacrilato de dietileno glicol (M(EO)2MA), 0,9 g de oligoethyleneglycol metacrilato (OEGMA475, 475 g/mol n = unidades de repetição de óxido de etileno da 7-8), 523 µ l de ácido acrílico (AA, comonômero) e 7,5 µ l de ácido thiolglycolic (TGA, agente de transferência de cadeia) dentro de um frasco de cintilação de vidro de 20 mL. Para PO0 (temperatura de transição de temperatura POEGMA), use 4,0 g de M(EO)2MA (sem OEGMA475). Para PO100 (nenhuma temperatura de transição POEGMA), use 4,0 g de OEGMA475 (não M(EO)2MA).Nota: Fase intermediária temperaturas de transição podem ser alcançadas com base na utilização de misturas intermédias de M(EO)2MA e OEGMA475, de acordo com Lutz et al . 23 Dissolva todos os reagentes em dioxano (monómero total de 5 mL/g) em um balão de fundo redondo com pescoços de um ou mais. Purga-se a reação com fluxo de nitrogênio (grau UHP) por 30 min. Uma vez purgados, coloca o balão em banho de óleo pré-aquecido a 75 ° C por 4 h sob nitrogênio e agitação magnética de 400 rpm. Após 4 h, remova o solvente usando um evaporador rotativo definido para 50 ° C e 200 rpm. Dissolva o produto resultante de polímero em 150 mL de água desionizada. Adicionar dihydrizide de ácido adípico (ADH) em um excesso molar cinco vezes o número de resíduos de AA incorporada do polímero (neste exemplo, AA compreende 29 mol % das unidades de monômero em polímeros produzidos, conforme titulação condutométricas). Ajuste o pH da solução a pH 4,75 usando 0.1 M HCl. Uma vez que o pH se estabilizou, adicionar N-(3-dimethylaminopropyl) -N’-ethylcarbodiimide (EDC) em um 5-fold molar excesso para o número de resíduos de AA presentes). Manter o pH de reação 4,75 com adição gota a gota de 0.1 M HCl mais 4 h. Embora a reação para agitar a noite. Despeje a solução do produto em três tubos de diálise longa ~ 30 cm (3500 Da peso molecular de corte, espessura de 1 polegada), usando um funil para minimizar derramamento. Use uma pinça de aperto para fechar o fundo do tubo antes do enchimento dobrando um segmento pequeno (~ 2 cm) do tubo para melhorar a integridade da braçadeira; repetição no topo (pressionando para remover as bolhas de ar) quando o recheio estiver concluído. Coloque os tubos no interior de um volume 100 vezes em excesso de água desionizada e deixe pelo menos 6 h, totalmente substituindo a água por seis ciclos de diálise para alcançar a pureza desejada. Lyophilize a amostra dializada para obter um produto final de polímero seco. 2. síntese de polímeros acrescida de aldeído Síntese do aldeído-Precursor monómero metacrilato de N-(2,2-Dimethoxyethyl) (DMEMA) Lugar de 200 mL de uma solução de NaOH 20% w/v para um balão de fundo redondo 500 mL 3 pescoço. Esfriar a solução em um banho de gelo e manter uma temperatura de 0 ° C com gelo durante a reação. Adicione 50 mL de acetal de dimetil aldeído aminoacetyl para a solução de NaOH a refrigeração. Adicionar 0,1 g de ritmo ((2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-yl) Oxil) e agitar a 400 rpm usando uma barra de agitação magnética até o TEMPO dissolve-se totalmente. Adicione 48 mL de cloreto de methacryloyl, gota a gota, usando uma bureta mais 2 h. Após 2 h, cobrir o recipiente de reação com papel alumínio e deixar mexer durante a noite. Extrair o produto adicionando o produto da reação de 75 mL de éter de petróleo em um funil de separação de 1 L, tremendo, desgaseificação, e descartando a camada superior. Repita a etapa 2.1.7 três vezes adicionando o produto da camada inferior de cada etapa de extração como o produto para o próximo ciclo de extração. Remova o produto de camada inferior final e a transferência para um copo de 100 mL. Adicionar ~ 5 g de sulfato de magnésio (Mg2SO4) para copo com monômero até uma “bola de neve” efeito é observado. Filtrar através de um 100 mL, funil de Buchner para remover o Mg2SO4. Enxágue o copo duas vezes com ~ 75 mL de éter metil terc-butílico, derramando a solução de lavagem através do funil cada vez. Transferir o produto para um balão de fundo redondo de 500 mL e evaporar o solvente usando um evaporador rotativo na temperatura de 200 RPM para coletar o produto final. Síntese de polímeros acrescida de aldeídoNota: A seguinte receita específica é fornecida para o polímero precursor POEGMA PNIPAM-mimética (PO10) com 30 functionalization de aldeído mol %. Polímeros de precursor PNIPAM e POEGMA com temperaturas de transição de fase diferentes podem ser preparados usando o mesmo método geral mas modificar o tipo e a proporção dos monômeros do núcleo usado (veja a seção 1.2 para modificações para diversos polímeros POEGMA)21 , 25 , 27. 37 mg de 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe), 3,10 g de dietileno glicol metacrilato M(EO)2MA, pesar 0,1 g de metacrilato de etilenoglicol oligo (OEGMA475, 475 g/mol, n = unidades de repetição de óxido de etileno da 7-8), 1,30 g de N-(2,2- acrilamida dimethoxyethyl) (DMEMA) e 7,5 µ l de ácido thiolglycolic (TGA) dentro de um frasco de cintilação de vidro de 20 mL. Para PO0 (temperatura de transição de temperatura POEGMA), use 4,0 g de M(EO)2MA (sem OEGMA475). Para PO100 (nenhuma temperatura de transição POEGMA), use 4,0 g de OEGMA475 (não M(EO)2MA).Nota: Fase intermediária temperaturas de transição podem ser alcançadas com base na utilização de misturas intermédias de M(EO)2MA e OEGMA475, de acordo com Lutz et al. 23 Dissolva todos os reagentes em dioxano (monómero total de 5 mL/g) em um balão de fundo redondo com pescoços de um ou mais. Purga-se a reação com fluxo de nitrogênio (grau UHP) por 30 min. Uma vez purgados, lugar de balão em banho de óleo pré-aquecido mantida em 75 ° C por 4 h sob nitrogênio e agitação magnética de 400 rpm. Após 4 h, remova o solvente usando um evaporador rotativo definido para 50 ° C e 200 rpm. Dissolver o produto resultante de polímero em 100 mL de deionizada H2O. Adicionar 50 mL de 1 M de HCl na solução dissolvida e mexa sob agitação magnética (400 RPM) por 24 h hidrolisar totalmente as funcionalidades de acetal em DMEMA. Após a conclusão da reação, transferi a solução de polímero para tubulação da diálise, conforme passo 1.13. Lyophilize a amostra dializada para obter um produto final de polímero seco. 3. fabricação de quitosana hidrazona granel hidrogel Dissolva maleica e polímeros de aldeído acrescido separadamente em solução salina de tampão fosfato 10 mM (PBS) ou qualquer tampão aquosa desejada, para criar soluções de concentrações desejadas.Nota: Concentrações de massa entre 5-40% em peso são normalmente usadas, com gelificação em concentrações inferiores possíveis se maior grupo funcional fracções estão presentes em polímeros. Usando uma seringa de cilindro único para transferir as soluções, carregar cada solução de precursor (~ 1 mL cada uma) em barris separadas de uma seringa de cano duplo (volume 2,5 mL, seringa de proporção 1:1) anexada a um misturador estático (1,5″ de comprimento) e (opcionalmente) uma seringa (normalmente de 18 G, 1.5″ comprimento para estudos in vitro) e (opcionalmente) uma seringa (normalmente 18 G, 1.5″ comprimento para estudos in vitro). Prepare moldes de diâmetro por perfuração de furos, forma e espessura desejada em uma folha de borracha de silicone.Nota: Em um experimento típico, um conjunto de soco padrão é usado para fazer um buraco de cilíndrico de diâmetro de 7 mm dentro de um 1/16″ espessura do silicone folha de borracha (volume total do reservatório ~ 300 µ l). O molde de silicone em um microscópio de vidro padrão deslize de tal forma que os furos perfurados no molde de montagem são completamente apoiados pelo vidro.  Uma lavagem de HCl 0,1 M do vidro é recomendada mas não obrigatório antes da montagem do molde de silicone. Co extrude o conteúdo da seringa de cano duplo através do misturador de estática para completamente preencher (ou ligeiramente encha demais, com um menisco na parte superior) o molde de silicone.Nota: Amostras múltiplas podem ser preparadas durante a amostra de uma extrusão desde o tempo de gelificação é na mesma ordem de magnitude ou mais que o tempo total necessário para preencher vários moldes. Coloque outro padrão de vidro de microscópio em cima do molde e aguardar a gelificação completar.Nota: As receitas padrão descritas na seção síntese gel dentro < 1 minuto; vezes mais lentos de gelificação (e, portanto, mais longos tempos de espera necessários) são observados em densidades mais baixas do grupo funcional, concentrações de polímero e/ou frações superiores de OEGMA475 em relação M(EO)2MA (para hidrogel POEGMA). Remova a lâmina de microscópio top e use uma espátula para empurrar o hidrogel longe o molde de borracha de silicone. Levante o molde da baixa de microscópio para recuperar o hidrogel para análise. 4. fabricação de micropartículas de Gel de quitosana hidrazona Fabricação de Chip Microfluidic Desidratar um wafer de silício (D = 76,2 mm, 380 µm de espessura, P-dopado, orientação) por aquecimento em uma chapa de fogão a 200 ° C por 5 min. Centro a bolacha em um aplicador de rotação e casaco de resistir a uma camada espessa de ~ 100 µm de SU-8 100 fotorresiste aplicando ~ 7 mL de SU-8, o spin de rampa de velocidade até 3000 rpm a uma taxa de 500 rpm/s e em seguida segurando a velocidade a 3000 rpm por 30 segundos. Pré-cozer o revestimento a 65 ° C por 10 min e em seguida macio-Asse o revestimento a 95 ° C por 30 min. Imprima uma Fotomáscara sobre uma transparência com o padrão de microfluidic definido pela Figura 2A, tal que as seções transparentes são o padrão desejado da camada fotorresiste polimerizado. Inserir o wafer de silício fotorresiste-revestido e a Fotomáscara em um alinhador de máscara e expor o wafer de 365 luz nm para 95 s (poder de exposição de 6.5 W). Asse a bolacha modelada durante 10 minutos a 95 ° C, primeiro colocando-o em uma placa de aquecimento a 65 ° C e posteriormente esquentando a chapa para 95 ° C a 10 ° C/min. Remova a bolacha da placa e coloque em um copo de 500 mL contendo desenvolvedor 100ml SU-8 pelo menos 10 minutos, agitando a bolacha lentamente na solução em toda para remover fotorresiste não-expostos. Depois de 10 min, enxaguar a bolacha estampada com isopropanol e seque com ar. Armazene a bolacha modelada em um ambiente fresco e seco, longe da luz quando não estiver em uso para moldagem de réplica de litografia macia. Coloque o molde microfluidic estampados em uma placa de Petri. Comprimentos de ~ 10mm posição do tubo de silicone 13 L/S sobre as entradas e saídas do chip. Despeje ~ 10 mL de poli (dimetil siloxano) (PDMS; preparado pela mistura de Base de elastômero de Silicone e agente de cura de elastômero de Silicone em uma proporção de 10:1) em cima do chip, evitando cuidadosamente incorporando qualquer PDMS dentro da tubulação do silicone colocado. Coloque o prato de Petri em uma câmara de vácuo para ~ 10 min remover as bolhas de ar, persistindo em e ao redor da estrutura padronizada durante a cura. Cure o PDMS, colocando a placa de Petri contendo o molde modelado e PDMS não polimerizada sobre uma chapa de fogão a 85 ° C, durante 2-3h. Cuidadosamente Retire o PDMS curado do wafer de silício modelado para expor macio litográficas estampados PDMS réplica do molde microfluidic. Lugar do PDMS padronizada e uma lâmina de vidro de ponta-cabeça em uma TV de plasma de alta potência com um alimentação de ar limpa. Aplicar o plasma em 200 mTorr e 45 W para 90 s para lig o PDMS para a lâmina de vidro e criar o chip microfluidic final. Síntese de micropartículas de Gel Preparar maleica-acrescida de PNIPAM (PNIPAM-Hzd) dissolvendo NIPAM (4,5 g), ácido acrílico (0,5 g – 15 monômero de total % mol), ácido tioglicólico (TGA, 80 µ l) e éster de ácido dimetil 2,2-azobisisobutyric (AIBME, 0,056 g) em 20 mL de etanol anidro e posteriormente seguindo passos 1.4-1.14 para completar a síntese, embora a mudança da temperatura de reação a 56 ° C na etapa 1.5. Preparar acrescida de aldeído PNIPAM (PNIPAM-Ald) dissolvendo NIPAM (4G), N-(2,2-dimethoxyethyl) metacrilato (DMEMA, 0,95 g – 13.4 monômero de total % mol), ácido tioglicólico (TGA, 80 µ l) e éster de ácido dimetil 2,2-azobisisobutyric (AIBME, 0,056 g) 20 mL de etanol e posteriormente seguindo passos 2.2.4-2.2.10 para completar a síntese, embora a mudança da temperatura de reação a 56 ° C na etapa 2.2.5. Dissolva Hzd-PNIPAM e PNIPAM-Ald em 6% em peso em água desionizada e carga em seringas de 5ml padrão separado. Dissolver 1 wt % não iónico surfactante (por exemplo, Span 80) em óleo de parafina pesado e carregar a solução em uma seringa de 60ml padrão. Conectar as duas precursor seringas de solução de polímero individualmente para os dois canais de entrada de polímero separada sobre o chip microfluídicos e a solução de óleo de parafina para o canal de entrada de óleo no chip microfluidic via 1/32″ do silicone ID tubulação (~ 30 cm de comprimento por entrada, ~ 45 cm de comprimento por saída). Usando duas separar bombas de seringa de infusão (um para o óleo de montante, um para o óleo adicionado após o bocal), entregar o óleo para o chip em uma taxa de fluxo entre 1,1 mL/h e 5,5 mL/h sem iniciar o fluxo de polímero para prime o chip e garantir que o chip está livre de defeitos e operacional (normalmente mantida ao longo de um período de 30 min). Usando uma bomba de seringa de infusão separadas, cada uma das soluções aquosas de polímero entrega o chip com um caudal de 0,03 mL/h. Após um período de estabilização inicial para garantir que o fluxo tem equilibrado e uniformes partículas são formadas (30 min – 1 h), recolha as partículas num balão de fundo redondo magneticamente mexido. Recolha as partículas até que todo o óleo consumido (55-12 h, dependendo do fluxo). Parar as bombas de seringa e, se desejado, imediatamente bombear água em substituição as soluções de polímero precursor pelo chip para limpar.  No entanto, dada a rápida gelificação in situ destes materiais quando o fluxo é interrompido, é recomendável usar um novo chip para cada experimento separado. Desligue a agitação magnética e permitir que o gel de micropartículas resolver. Decante o óleo de parafina disponíveis todos usando uma pipeta. Para remover o restante óleo de parafina, lave as gel de micropartículas com pentano (aplicado em um volume de 10 mL para cada 0,5 mL de micropartículas de volume), misture vigorosamente a emulsão para ~ 1 minuto, permitir que o gel de micropartículas de re-contentar-se ~ 1-2 horas e decantar fora a fase orgânica residual com uma pipeta. Repita pelo menos 5 vezes para assegurar a remoção de óleo de parafina completo. Resuspenda as micropartículas de gel em 10 mL de água desionizada dentro de um frasco de cintilação de vidro de 20 mL e purgar o frasco com nitrogênio durante a noite para remover qualquer pentano residual. 5. fabricação de hidrazona quitosana Nanogels Dissolver as soluções de PNIPAM-Hzd (1 w/v%) e PNIPAM-Ald (1 w/v%) em água desionizada. Prepare Hzd-PNIPAM e PNIPAM-Ald conforme descrito nas seções 4.2.1 e 4.2.2, respectivamente. Aqueça uma alíquota de 5 mL da solução estoque para 70˚C de PNIPAM-Hzd usando banho de óleo, sob agitação magnética (350 RPM) dentro de um frasco de cintilação de vidro de 20 mL.Nota: A solução deve tornar-se opaco (ou seja, a temperatura ultrapassa a temperatura mais baixa solução crítica do PNIPAM-Hzd), mas não precipitado visível deve ser formado. Adicionar uma alíquota de 0,25 mL de PNIPAM-Ald (5-20% em peso da massa de PNIPAM-Hzd presentes na solução semente) algumas para a solução de PNIPAM-Hzd aquecida durante um período de 5 a 10 s. Continue misturando que a solução na cintilação frascos para um adicional de 15 minutos, depois que remover o exemplo do banho de óleo e deixe o produto arrefecer à temperatura ambiente durante a noite. Dialize o nanogels resultante sobre ciclos de 6 x 6 horas (usando uma membrana de diálise MWCO kDa 3500) contra água desionizada para remover qualquer polímero não-quitosana. Se desejado, lyophilize para o armazenamento. 6. fabricação de nanofibras de quitosana hidrazona Preparar maleica-acrescida de POEGMA (POEGMA-Hzd) dissolvendo-se 37 mg dimetil 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe), metacrilato de oligoethyleneglycol de 4,0 g (OEGMA475, 475 g/mol, n = unidades de repetição de óxido de etileno da 7-8) e 0,25 g de ácido acrílico (AA) em dioxano 20ml e seguindo passos 1.3-1.14 para completar a síntese. Preparar acrescida de aldeído POEGMA (POEGMA-Ald) dissolvendo 50mg dimetil 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe), metacrilato de oligoethyleneglycol de 4,0 g (OEGMA475, 475 g/mol, n = unidades de repetição de óxido de etileno da 7-8) e 0,60 g N-(2,2- metacrilato de dimethoxyethyl) (DMEMA) em 20 mL dioxano e seguir as etapas 2.2.3-2.2.10 para completar a síntese. Dissolver Hzd-POEGMA (15% em peso) e POEGMA-Ald (15% em peso) em soluções separadas de água desionizada. Dissolver o poli (óxido de etileno) (PEO, Mw= 600 x 103 g/mol, 5% em peso) em água desionizada.  Misturar 1 mL da solução de PEO com cada solução POEGMA reativa, preparada na etapa 6.3 para criar soluções de final precursor do polímero do 7.5 wt % POEGMA precursor e 2,5% em peso PEO. Carregar as duas soluções em barris separados da mesma seringa cano duplo descrito na seção 3 (incluindo também o misturador estático 1.5″) e montar a seringa de cano duplo em bomba de infusão seringa. Anexe um misturador estático e uma agulha de 18G sem corte-dica para a seringa de cano duplo. Conecte uma fonte de alimentação de alta tensão para a agulha de ponta sem corte, de castigo para o coletor.Nota: Colecionadores consistem de um quadrado de 10 x 10 mm de alumínio ou um ~ 10 mm diâmetro disco de alumínio girando a uma velocidade de 200 rpm, ambos montagem perpendicularmente na agulha a uma distância de 10 cm da extremidade da agulha. Ligue a bomba de seringa, a uma taxa de 0,48 mL/h e, simultaneamente, ligue uma alta tensão de 8,5 kV para executar a eletrofiação e criar nanofibras. Continue a eletrofiação conforme desejado para fazer andaimes de espessuras diferentes ou até ao esgotarem das soluções de entrada. Para remover o auxílio de eletrofiação PEO, mergulhe os andaimes coletados por 24 h em água desionizada.

Representative Results

Hidrogel granel extrudadas de uma seringa de cano duplo em um molde de silicone de acordo com as dimensões do molde e tornar-se independente após a remoção do molde; gelificação ocorre tipicamente segundos a minutos seguinte co-extrusão dependendo de precursores de polímero usado. Caracterização típica através de inchaço (medido por gravimetria usando uma inserção de cultura celular para retirar facilmente o hidrogel da solução inchaço), thermoresponsivity (medido usando a mesma técnica mas ciclismo acima da temperatura de incubação e abaixo da temperatura de transição fase), degradação (medido usando a mesma técnica mas por longos períodos de tempo) e tesoura ou módulo de elasticidade à compressão (medido usando amostras de 2 mm de espessura e 7 mm diâmetro moldada) demonstra o pré-definido do hidrogel respostas, dependendo da química do polímero precursor (especificamente, para POEGMA, a proporção de curto de monômeros de cadeia longa OEGMA usados para preparar o hidrogel), a fração molar de grupos funcionais em polímeros o precursor e a concentração desses precursor de polímeros (Figura 5)27. Microfluídica leva à formação de micropartículas de gel bem definido na escala de tamanho de 25-100 µm, com o tamanho controlável com base nas taxas de fluxo de óleo e/ou o polímero aquosa combinada de fases (figura 6A)31. Microscopia óptica de estágio quente confirma que as micropartículas de gel de mantenham a natureza thermoresponsive de hidrogel a granel, mostrando reversível dependente da temperatura inchaço-deswelling com apenas uma ligeira histerese no ciclo 1 (atribuível a formação de ligação de hidrogênio irreversível entre vizinhos grupos Amida no estado recolhido34) consistente com a observada em massa PNIPAM hidrogel (Figura 6B)32. Além disso, as gel de micropartículas degradam volta aos seus precursores oligoméricas ao longo do tempo, permitindo a liberação renal (Figura 6)32. Auto-montagem impulsionado pelo nanoaggregation de um polímero PNIPAM maleica-acrescida em uma solução aquecida seguido de reticulação com uma acrescida de aldeído PNIPAM polímero resulta em altamente monodisperso nanogels (polidispersividade < 0.1) sobre o faixa de tamanho de 180-300 nm, dependendo das condições do processo utilizado (Figura 7A)28. Os nanogels manter o comportamento típico de thermoresponsive de nanogels PNIPAM de quitosana convencional de radicais livres, com graus mais baixos de deswelling térmica observada como polímero mais do cross-linking foi adicionado (Figura 7-B). O nanogels pode ser liofilizado e redispersa sem uma mudança no tamanho de partícula (Figura 7C) e degradar ao longo do tempo através de hidrólise para re-formar os polímeros oligoméricas precursor usados para formular o nanogels (Figura 7D). Eletrofiação reativa cria um nanofibrous estrutura de hidrogel (Figura 8A), com diâmetros de nanofibras da ordem de ~ 300 nm realizável sem partículas visíveis electrosprayed apresentam33. Embeber as nanofibras baseado em POEGMA em água resulta em rápida hidratação (mais ou menos duas ordens de magnitude mais rápidas do que o alcançado com um gel de volume da mesma composição, Figura 8B), mas mantém a morfologia de nanofibrous mais de 8-10 semanas antes de degradação hidrolítica em condições fisiológicas; degradação mais rápida é observada em ambientes catalisada por ácido, como esperado devido ao potencial de degradação de vínculo catalisada por ácido hidrazona (Figura 8C). As estruturas nanofibrous são também mecanicamente robustas em ambos os Estados secos e inchados ao longo de vários ciclos, permitindo fácil manuseio e repetitivas esticando (Figura 8D). Figura 5 : Propriedades de in situ -coagulação granel hidrogel degradáveis thermoresponsive. (A) POEGMA representante do gel microestruturas de rede e imagens de hidrogel em massa com tempos de gelificação correspondentes em função da incorporação mole % da OEGMA475 em polímeros do precursor; (B-C) Módulo de armazenamento de hidrogel de100 PO por variável concentração de polímero de precursor (B) e a (C) toupeira % grupo funcional incorporação por polímero precursor; (D-F) Propriedades físico-químicas de hidrogel POEGMA em função da incorporação de % OEGMA475 mole: perfil de degradação de módulo de elasticidade (E) (D) armazenamento em 1 M de HCl e a temperatura de transição de fase (F) volume em resposta à temperatura mudam sobre a faixa de 20-60 ° C. Todas as barras de erro representam o desvio padrão de n = 4 medições de replicar. Adaptado de referência27 com permissão da Elsevier. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6 : Propriedades do gel de degradáveis micropartículas de microfluídica reativa. (A) efeito da taxa de fluxo de óleo de parafina em gel (purificado) tamanho de micropartículas na água; (B) Thermoresponsivity de gel purificada de micropartículas na água após um único ciclo térmico acima e abaixo da temperatura de transição de fase de volume; Avaliação Visual (C) (fotos) e vestígios de cromatografia de permeação gel (gráfico) confirmando a degradação de gel de micropartículas de volta aos seus componentes de polímero precursor (aqui, em 1 M HCl para facilitar a degradação acelerada da escala de tempo da imagem); barra de escala = 100 µm. adaptado de referência32. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7 : Propriedades de nanogels degradáveis de reativo auto-montagem. (A) distribuições de tamanho de partícula de nanogels preparado com relações de massa diferentes aldeído: maleica polímero de difusão dinâmica da luz (baixo-relevo: micrografia eletrônica de transmissão confirmando a natureza esférica da nanogels); (B) Thermosensitivity de partículas Self montadas em função da proporção em massa entre polímero aldeído: maleica usado para preparar o nanogels (de difusão dinâmica da luz), com barras de erro, que representa o desvio padrão de n = 4 repetições; Confirmação Visual (C) da falta de agregação nanogel tanto pré e pós-liofilização; (D) visual confirmação da degradação catalisada por ácido de nanogels (aqui em 1 M HCl para consistência com outros estudos acima); (E) gel permeação cromatógrafo vestígios de produtos de degradação nanogel, indicando a sua semelhança com o maleica e polímeros de aldeído-acrescida de precursor. Adaptado com permissão de referência28. Copyright 2015, sociedade americana de química. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 8 : Propriedades de nanofibras degradáveis de reativa eletrofiação. (A) microscopia eletrônica imagens de nanofibras no seco (à esquerda), do estado metade mergulhado na água (média, fina película) e totalmente embebidas em água durante a noite (bem, de grosso andaime); (B) inchaço de hidrogel de nanofibrous (vermelho) em relação a um hidrogel de granel (azul) da mesma composição, com barras de erro, que representa o desvio padrão de n = 4 repetições; (C) varredura microscopia eletrônica e (inset) imagens visuais rastreando a degradação catalisada por ácido de nanofibras em 1 M HCl; (D) ciclismo resistência à tração de seco (80 ciclos, 20% de alongamento/ciclo) e inchados (325 ciclos, alongamento/ciclo de 10% em PBS de 10 mM) electrospun nanofibrous de hidrogel. Figura modificada de referência33 e reproduzido com permissão da Real Sociedade de química. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Temos aplicado com êxito todas estas técnicas de fabricação de vários sistemas de polímero usando apenas pequenas variações dos métodos descritos em detalhe acima para PNIPAM e POEGMA; no entanto, os usuários destes protocolos devem ser conhecedores dos problemas potenciais que podem surgir quando outros polímeros são substituídos para estes processos. Em particular, aumentando a viscosidade dos polímeros precursor pode afetar negativamente a capacidade de processamento (especialmente no método microfluidic) bem como a eficiência de mistura dos polímeros dois precursor. Além disso, o tempo de gelificação dos polímeros deve ser controlado em uma taxa dependente a morfologia direcionada a fim de evitar a gelificação prematura que serve para inibir o fluxo ou prevenir interdifusão dos reativos pré-polímeros, essenciais para formar o desejado estruturas de gel homogêneo. As limitações específicas de cada estratégia, bem como abordagens que utilizámos para adaptar essas abordagens para resolver tais limitações em cada escala de comprimento de fabricação, são descritas abaixo.

Hidrogel através de co-extrusão de cano duplo seringa a granel
Tempo de gelificação é a variável-chave de controle para garantir a eficácia da técnica para formar maiorias hidrogel seringa cano duplo. Polímeros que muito rápido em cima do contato do gel ( 5 s são preferíveis (embora não seja obrigatório) para o uso desta técnica; Isto é particularmente importante se replicar hidrogel está sendo convertido para análises físicas ou mecânicas garantir que cada elenco de hidrogel tem a mesma composição. Tempo de gelificação pode ser facilmente alterado, alterando a densidade de determinados grupos funcionais em um ou ambos os polímeros precursor (menor densidade de grupo funcional, levando a gelificação mais lenta) ou alterando a concentração dos polímeros precursor usado para formar o gel ( reduzir as concentrações levando a gelificação mais lenta)21. Alternadamente, substituindo o grupo aldeído (mais reativo) com o grupo cetona (menos reativo) como o eletrófilo no par coaguladas significativamente reduz o tempo de gelificação sem alterar significativamente a composição do hidrogel resultante35 ; polímeros preparados com misturas de aldeído e precursores monoméricos cetona podem ser usados para ajustar o tempo de gelificação como desejado sem alterar a concentração de polímeros de precursor usado (e, portanto, a percentagem em massa de sólidos no gel resultante formada).

Constatamos também que o primeiro elenco de hidrogel não tem sempre as mesmas propriedades como hidrogel subsequente conversão, uma observação atribuída a pequenas diferenças na taxa na qual o conteúdo dos dois barris realmente alcançar o misturador estático. Como resultado, nós tipicamente encha a seringa de cano duplo, expulsando um pequeno (< 0,3 mL) fração de gel antes de iniciar o processo de fundição para minimizar tal variabilidade. Finalmente, enquanto não é normalmente problemático quando usando oligoméricos pre-polímeros sintéticos de, a viscosidade de uma ou mais soluções de polímero precursor pode representar um desafio no contexto desta técnica, tanto em termos de facilitar o fluxo usando a depressão simples polegar bem como promover a mistura eficaz dentro do misturador estático. No entanto, surpreendentemente, até soluções de polímero precursor com acentuadamente diferentes viscosidades ainda formam hidrogel relativamente homogênea usando os acessórios de misturador estático descritos na lista de peças (por exemplo, PNIPAM com uma alta molecular peso carboidratos26), sugerir que preocupações com mistura ineficiente como resultado de viscosidades desencontradas pode não ser significativo, pelo menos na escala de massa. Se necessário, a utilização de uma bomba de seringa (em vez do polegar) ao fluxo de movimentação e/ou o uso de uma agulha de calibre maior na tomada pode ajudar superar problemas associados com extrudability nestes sistemas.

Microescala hidrogel através de microfluídica reativa
A etapa chave associada com a abordagem de microfluídica para fabricação de micropartículas de gel é a escorva do chip Microfluido com os dois polímeros reativos. Se os polímeros são entregues com pressões diferentes ou em taxas diferentes no chip, a pressão diferencial pode dirigir o refluxo da solução de polímero um precursor no reservatório (ou pelo menos em direção ao reservatório) do outro polímero precursor. Isso resulta em gelificação montante da formação de partículas, efetivamente bloqueando o fluxo e exigindo a eliminação de chip. O caminho tortuoso imprimido entre cada reservatório e o ponto de misturando cria uma resistência significativa para retorno; no entanto, até mesmo um operador treinado ocasionalmente gel um chip antes de um regime estável de fluxo é alcançado. Baseado em nossa experiência, entre 1-2 min é normalmente necessário para estabilizar os fluxos após o início da formação da gota (ao longo da qual relativamente polydisperse gel de micropartículas são produzidas); Se não há problemas são observados dentro dos primeiros 5 a 10 minutos de operação, é provável que várias horas de produção de partículas monodisperso contínua podem ser alcançadas. O uso de polímeros de precursor com viscosidades relativamente bem-acompanhado, bem como tempos de gelificação não instantânea (pelo menos > 15 s preferível) auxilia muito em evitar tais problemas e promover a formação de fluxos estáveis.

Nota que vário fluem taxas variando de 0.01-0.1 mL/h na fase aquosa e 1.1-5.5 mL/h na fase de óleo foram testados usando esse projeto de microplaqueta, levando para a fabricação de partículas na faixa de tamanho de ~ 25-100 µm de acordo com o cisalhamento aplicado na junção de fluxo-foco; taxas de fluxo mais rápidas equacionam a tesoura maior e assim partículas menores formaram31,32. Variando a taxa de fluxo de óleo mantendo a taxa de fluxo aquoso total baixa (~0.03 mL/h, como citado no protocolo) foi encontrada para ser mais eficiente para controlar o tamanho de micropartículas de gel sem comprometer ou monodispersity ou o tempo de vida do dispositivo, os quais foram observada a diminuir significativamente na extremidade mais elevada das taxas de fluxo aquoso total citado. Maiores taxas de fluxo de óleo (> 5,5 mL/h) para criar partículas menores são possíveis, mas aumentou o risco de delaminação da microplaqueta (uma limitação comum encontrada com plasma-ligado PDMS microfluidic chips). Os chips usando um outro método de ligação pode permitir taxas de fluxo mais rápidas e, portanto, menor produção de micropartículas de gel, uma estratégia que estamos actualmente a explorar. Diminuir o tamanho do bocal também pode ajudar a reduzir o tamanho das micropartículas que poderiam ser produzidos, embora a um risco acrescido de gelificação prematura antes da formação de partículas. Taxas de fluxo mais lentas tendem a originar um fluxo instabilidades e, portanto, dispersões maior e um risco aumentado de gelificação de chip; Esta limitação pode ser superada por meio de um sistema de controle de fluxo de microfluidic multicanal que tem maior estabilidade e maior resolução do que as bombas de seringa padrão usado no presente protocolo.

A escolha do óleo foi fundamental para o sucesso do presente protocolo, como óleos mais pesados (favoráveis em termos de impedir a aglomeração de micropartículas de gel após a coleta) levou à formação de partículas muito menos consistente no bocal do que o óleo de silicone de luz relatado em o protocolo. Nós hypothesize que este reduzido reprodutibilidade é um resultado da consistência inferior da seringa, bombeamento de óleos pesados, levando a mais variável de cisalhamento no ponto de mistura. Evitando a agregação de micropartículas de gel no recipiente de coleta também foi um desafio, particularmente imediatamente na saída do dispositivo microfluidic nesse ponto em situ gelificação não foi completos e grandes números de disponível reativos funcional grupos estavam disponíveis para pontes de formulário entre partículas colidindo no banho de coleção. Este desafio é dirigido por: aumentar o comprimento do canal de saída do chip microfluidic em si, mantendo as gel de micropartículas em fluxo laminar por um longo período de tempo para promover mais completa gelificação; adicionando os canais de lado após o bico para alimentar mais óleo para o chip e, assim, separar melhor as gel de micropartículas neste canal pós-mistura sem afetar os campos de cisalhamento no bocal em si ou a taxa de produção de partículas; e adicionando um misturador magnético no balão de coleta para evitar a sedimentação de micropartículas do gel e manter uma maior separação média entre partículas adjacentes. Enquanto polímeros coagulados muito lentos provavelmente iria melhorar a estabilidade do dispositivo e minimizar problemas com escorva, tais sistemas também foram observados para aumentar significativamente o risco de agregação de micropartículas de gel, como um número maior de determinados grupos funcionais permanece não tenha reagido (e assim poder pontes de forma inter partícula) durante um longo período de tempo. Como tal, tempos de gelificação da ordem de 15-60 s parecem ser o ideal para esta técnica: lento suficiente para lhe permitir a escorva, mas rápido o suficiente garantir mais reativos grupos funcionais é consumido antes da gel de micropartículas saindo do canal de fluxo laminar para o balão de coleção.

Finalmente, a remoção do óleo modelagem é essencial para garantir que as partículas resultantes mantêm que as propriedades inteligentes anteciparam com base na composição dos pré-polímeros adicionados e permitir o uso destas partículas em um contexto biomédico. O pentano lavagem procedimento descrito foi altamente eficaz a este respeito para a produção de micropartículas de gel de geral. No entanto, a aplicação desta técnica em um contexto biomédico direto (por exemplo, encapsulamento de chip de celular) exigiria a reavaliação do presente protocolo. Também exploramos o uso de óleo de oliva, sugerido para ser que um óleo mais inerte no contexto de entrar em contato com células36, como o dispersante. Enquanto a formação de partículas foi possível, as populações de micropartículas de gel foram significativamente mais polydisperse do que poderia ser alcançado com óleo mineral, pelo menos com o atual projeto de microplaqueta. Assim, enquanto o chip parece ser adaptável ao polímero sintético e de formação do polímero natural gel de micropartículas31, um projeto modificado pode ser necessário para explorar esta técnica mais amplamente em todas as combinações possíveis de material.

Nanoescala hidrogel através de reativa Self-assembly
Nanogels ter sido formados usando uma vasta gama de condições, incluindo diferentes concentrações de polímero de semente de processamento (0,5-2% em peso), diferentes proporções de polímero crosslinking:seed (0,05-0,2), a diferentes temperaturas (40-80 ° C), a mistura diferentes velocidades ( 200-800 rpm) e aquecimento diferente tempos após a adição do agente reticulante polímero (2-60 min)28. Em termos de concentrações, as tendências observadas são geralmente como iria ser previsto, como altas concentrações de polímero sementes levam a maior nanogels e percentagens mais elevadas de polímero de crosslinker:seed levam a nanogels com maiores densidades de crosslink e assim diminuir thermoresponsivities. Ressalta-se que aumentando o polímero de semente concentração muito alta acaba por conduzir a agregação em oposição a nanoaggregation, consistente com o que se observa no processo de precipitação convencional radical livre para formar a granel thermoresponsive nanogels3. Tempos mais curtos de aquecimento também foram encontrados para ser favorável para formar menores e mais partículas monodisperso. Nós hypothesize que apontando o nanoaggregate vezes mais tempo a uma temperatura superior a LCST um ou ambos os polímeros precursor aumenta a probabilidade de agregação após colisão de nanogel, com a maior hidrofobicidade do vínculo relativo a hidrazona ou os precursor aldeído ou maleica grupos funcionais tornando esta agregação mais provável como o grau de reticulação alcançado é aumentado. Em última análise, tempos mais curtos de aquecimento são favoráveis de uma perspectiva de processo, como uma população de nanogel monodisperso pode ser formada em menos de 2 min após a adição de polímero crosslinker; 10 min foi encontrado para ser o maior tempo que consistentemente poderia produzir monodisperso nanogels permitindo também para a produção de mais altamente reticulado nanogels. Curiosamente, o método é muito insensível à mistura, com tamanhos de partícula quase idênticos e distribuições de tamanho de partícula resultante da mistura em velocidades diferentes ou mesmo escala o processo para volumes maiores. Enquanto inicialmente surpreso com esse resultado, provavelmente fala para o papel principal da termodinâmica na regulação da produção de nanogel.

Para conseguir baixa dispersões, a estabilidade coloidal e o grau de hidratação do nanoaggregate parecem ser as principais variáveis. Por exemplo, preparadas com os polímeros maleica-acrescida mais hidrofílicos como a semente em oposição as polímeros menos hidrófilos aldeído-acrescida de nanoaggregates levar a nanogels com dispersões significativamente menor. A diferença entre a temperatura de montagem experimental e a LCST do polímero semente também é fundamental. Operando a uma temperatura acima do polímero de semente LCST ((T-LCST) < 5 ° C) oferece a maior probabilidade de formação de nanogel monodisperso; operam bem acima da LCST cria mais hidrofóbicos e recolhido nanoaggregates que são mais propensos a agregação e menos probabilidade de crosslink, ao operar-se abaixo os resultados da LCST em um polímero de sementes relativamente não-compacto que não podem ser eficazmente ou reproducibly quitosana. Para a melhor previsão da partícula monodispersity, recomendamos que primeiro executar uma verificação de UV/vis para medir o início LCST do polímero semente e posteriormente realizar a auto-montagem processo a uma temperatura de 1-2 ° C acima que LCST.

Observe que nanogels produzidos usando este método poderia ser liofilizado e redispersa sem qualquer alteração na estabilidade coloidal, muitas vezes não é possível para estruturas Self montadas e em nossa opinião atribuível ao nosso método de estabilização de reticulação. Esperamos também que apenas o polímero de semente precisa ser thermoresponsive para este método de trabalho; uso do Cross-Linking polímeros que são não-responsivos ou responsiva a outros estímulos mais pode ampliar a aplicabilidade final desta técnica. Finalmente, desde que a mistura de dois polímeros precursor reativa é neste caso passivo em oposição ao tempo de gelificação ativo, é muito menos importante em termos de controle de processo em relação as outras estratégias de fabricação descrito. No entanto, mesmo nesta técnica, mantendo o tempo total de reticulação < 30 min é desejável para minimizar o risco de agregação de partículas.

Hidrogel de Nanofibrous através de reativa eletrofiação
Controlando o tempo de gelificação dos reativos pré-polímeros novamente é essencial para o sucesso da produção de gel de nanofibras. Em particular, de correspondência aproximadamente o tempo de permanência dos polímeros precursor no misturador estático (controlada alterando a taxa de fluxo da solução da seringa de cano duplo, bem como o comprimento e tortuosidade do misturador estático) com a gelificação em massa tempo dos polímeros precursor é essencial tanto para preservar a spinnability, bem como assegurar a eficaz reticulação das fibras fiadas entre a agulha e o coletor. Mais rápida gelificação leva ao desenvolvimento de cone de Taylor ineficaz e, portanto, spinnability pobre, enquanto resultados de gelificação mais lentos em solução aquosa, em vez de um gel batendo o coletor, resultando na difusão e a formação final de um filme fino gel em vez de nanofibras. Trabalhar em residência vezes ligeiramente abaixo do tempo de gelificação em massa também foi encontrado para ser eficaz (e certamente preferível reduzir o risco de entupimento da agulha) desde que a evaporação da água como a solução é girada efetivamente concentra os polímeros precursor na de fluxo e, portanto, acelera a cinética de gelificação durante o processo de fiação. Nesta mesma veia, operando em maiores distâncias de agulha-para-coletor (> 10 cm) é geralmente favorável neste processo, como distâncias mais curtas, reduzem o tempo disponível para evaporação da água e portanto necessitam de controle mais rigoroso sobre a relação entre tempo de residência e tempo de gelificação para preservar um produto nanofibrous.

Note que o uso de PEO (ou outro alto peso molecular e facilmente electrospun polímero) é essencial neste protocolo para promover a formação de nanofibras, como os oligómeros POEGMA curtos e altamente ramificados sozinho não podem alcançar um grau adequado de entrelaçamento para induzir eletrofiação; em vez disso, os resultados de electrospray de todo processo condições testadas para formulações de apenas POEGMA (embora isto pode também ter aplicativos para fazer gel de degradáveis partículas usando esta mesma química). Uma concentração de 1% em peso (peso molecular de MDa 1) PEO é necessária para manter uma morfologia totalmente nanofibrous. Observe que o PEO pode ser removido das fibras após um processo de imersão simples (água deionizada, 24 h) sem interromper a integridade da rede nanofibrous; desta forma, PEO age mais como um auxílio eletrofiação transitória do que um componente essencial do produto final nanofibrous. Observe também que vários tipos de coletores, incluindo folha de alumínio simples (para criar o hidrogel de camada fina que pode delaminate do coletor de mediante imersão), bem como um disco rotativo de alumínio (para criar andaimes mais grossos) podem ser usados em conjunto com este mesmo técnica, desde que as outras variáveis de processo controlando a taxa de gelificação, a taxa de eletrofiação e a taxa de evaporação da água durante a eletrofiação permanecem inalterados.

Curiosamente, dependendo do método usado para preparar as morfologias diferentes, diferenças significativas foram observadas nos tempos de degradação de hidrogel preparadas a partir dos precursores de hidrogel mesmo. Por exemplo, POEGMA nanofibrous hidrogel degrada mais lentamente do que o hidrogel POEGMA em massa com a mesma composição, apesar de sua superfície significativamente maior e, portanto, acesso à água para hidrolisar as ligações hidrazona. Nos relacionamos estas diferenças para os contrastes inerentes entre os protocolos descritos em termos da geometria de misturar os polímeros de precursor, o que podem levar a homogeneities gel interno e/ou morfologias que são significativamente diferentes e/ou a em situ concentração de precursores de polímero na mesma escala de tempo como gelificação, particularmente relevante em eletrofiação devido a evaporação da água simultânea e reticulação observado neste processo. Enquanto isso pouco pode complicar a escolha dos polímeros precursor se um polímero é direcionado para uso em cada protocolo, ele também pode oferecer uma oportunidade de técnica em termos de hidrogel com uma composição química, propriedades físicas muito diferentes, mas.

Em geral, os métodos descritos fornecem uma estratégia para fabricar degradáveis (ou pelo menos uma clearable) análogos de polímeros thermoresponsive em várias escalas de comprimento (granel, micro e nano) e com vários tipos de estruturas internas (partículas ou fibras). Esses protocolos abordar as barreiras chaves para a sucesso tradução de materiais convencionalmente preparados sintéticos thermoresponsive ao campo biomédico: Injectabilidade e degradabilidade. Nós estamos continuando a explorar a aplicação de tais materiais em entrega de droga e tecido engenharia de aplicações que vão desde a segmentação física de cânceres, o transporte de drogas através da barreira hemato – encefálica, a entrega terapêutica de proteínas no parte de trás do olho, o direcional crescimento dos tecidos e o thermoreversible adesão e diferenciação das células, entre outras aplicações.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financiamento de ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC), a criar NSERC-IDEM (projeto integrado de matrizes extracelulares) program, 20/20: NSERC oftálmica Biomaterials Research Network e o Ministério da pesquisa em Ontário e Programa de início pesquisador prêmios de inovação é reconhecido.

Materials

Chemicals
2,2 – azobisisobutryic acid dimethyl ester Wako Chemicals 101138
Di(ethylene glycol) methyl ether methacrylate (M(EO)2MA) Sigma Aldrich 447927 188.2 g/mol, n=2 ethylene oxide repeat units
Oligo (ethylene glycol) methyl ether methacrylate (OEGMA475) Sigma Aldrich 447943 475 g/mol, n=8-9 ethylene oxide repeat units
Acrylic acid (AA), 99% Sigma Aldrich 147230
Thioglycolic acid (TGA), 98% Sigma Aldrich T3758
Dioxane, 99% Caledon Labs 360481
Nitrogen, UHP grade Air Liquide Alphagaz1 765A-44
Adipic acid dihydrazide (ADH), 98% Alfa Aesar A15119
N'-ethyl-N-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC, x%) Carbosynth FD05800
Hydrochloric acid (HCl), 37% Sigma Aldrich 320331
Sodium hydroxide (NaOH), 97% Sigma Aldrich 221465
Aminoacetyl aldehyde dimethyl acetal, 99% Sigma Aldrich 121967
4-Hydroxy-TEMPO, 97% Sigma Aldrich 176141
Methacryloyl chloride,97x% Sigma Aldrich 523216
Petroleum ether, 95% Sigma Aldrich 32047
Magnesium sulfate, 99.5% Sigma Aldrich M7506
tert-Butyl methyl ether, >99.0% Sigma Aldrich 443808
Phosphate buffered saline BioShop PBS405.1 1x, pH 7.3-7.5
N-isopropylacrylamide, 99% J&K Scientific 258717 Recrystallized from 60% hexanes/40% toluene
Ethanol, anhydrous Commerical Alchols P016EAAN
Span 80 Sigma Aldrich S6760
Heavy paraffin oil Caledon Labs 1326197
Pentane, reagent grade Caledon Labs 1/10/7800
Poly (ethylene oxide) average Mv 600,000 Sigma Aldrich 182028
Supplies essential for synthesis and hydrogel fabrication
Rotary evaporator Heidolph G3
Dialysis tubing (3500 Da molecular weight cut-off) Spectrum Labs 28170-166 Vol/length= 6.4mL/cm
Double barrel syringe Medmix L series L series, 2.5 mL, 1:1 volume ratio
Static mixer Medmix L series L series, 2.5 mL, 1:1 volume ratio, 1.5" length
Silicone rubber sheet, 1/16" thickness McMaster-Carr 9010K12, 30A Durometer (Super Soft)
Syringe pump KD Scientific KDS Legato 200 Infuse Only Dual Syringe Pump
High voltage power supply Spellman 230-20R 0 to 20 kV
Microfluidic Chip Fabrication
Silicon wafer University Wafer 2080 D = 76.2 mm; 380 µm thickness; P-doped; <100> orientation 
SU-8 100 MicroChem Y131273
SU-8 Developer MicroChem Y020100
Custom 2.5" spincoater Built in-house N/A
Mask Aligner KARL SUSS MJB3 UV400 (with a 276 W lamp)
Masterflex L/S 13 Silicone Tubing Cole Parmer OF-96400-13 Peroxide-cured
Dow Corning Sygard 184 Silicone Elastomer Base  Ellsworth Adhesives 4019862
Dow Corning Sygard 184 Silicone Elastomer Curing Agent  Ellsworth Adhesives 4019862
High Power Plasma Cleaner  Harrick PDC-002-HP
Characterization Instruments
Mach 1 micromechanical tester Biomomentum LB007-EN
Cellstar tissue culture 12 well plate Greiner Bio-one 665 180
Cell culture insert for 12 well plate Corning 08-771-12 8 µm pore size
Optical microscope Olympus BX51 optical microscope BX51
Temperature-controlled microscope stage Linkam Scientific THMS600
Gel permeation chromatograph (GPC) Waters 590 HPLC Pump Waters Styragel columns (HR2, HR3, HR4; 30 cm x 7.8 mm (ID); 5 mm particles), Waters 410 refractive index detector
Dynamic light scattering (DLS) Brookhaven 90Plus Particle Size Analyzer
Transmission electron microscopy (TEM) TEMSCAN JEOL 1200EX Accelerating voltage 100 kV
Scanning electron microscopy (SEM) Tescan Vega II LSU Accelerating voltage 10 kV
Microsquisher CellScale Biomaterials Testing MS-50M-01
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References

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Sivakumaran, D., Bakaic, E., Campbell, S. B., Xu, F., Mueller, E., Hoare, T. Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning. J. Vis. Exp. (134), e54502, doi:10.3791/54502 (2018).
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