תאי גזע עצביים (NSCs) להתייחס לתאים אשר יכול עצמית לחדש ולבדל לשלוש השושלות עצביות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לקבוע תדירות המל"ל באוכלוסיית תא נתונה באמצעות neurosphere היווצרות והבחנה בתנאים משובטים.
תאי גזע עצביים (NSCs) יש את היכולת עצמית לחדש וליצור השושלות העצביות העיקריות השלוש – האסטרוציטים, נוירונים oligodendrocytes. NSCs ואת אבות עצביים (NPS) מתורבתים נפוץ במבחנה כמו neurospheres. פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לקבוע את התדירות המל"ל באוכלוסיית תא נתונה בתנאים משובטים. הפרוטוקול מתחיל עם הזריעה של התאים בצפיפות המאפשרת דור neurospheres המשובט. Neurospheres מועבר לאחר מכן coverslips התאי בדיל בתנאים משובטים במדיום מותנה, אשר ממקסם את פוטנציאל הבידול של neurospheres. לבסוף, תדירות המל"ל מחושבת על בסיס יכולות היווצרות multipotency neurosphere. כלי עזר של פרוטוקול זה כולל את הערכה של סמנים המל"ל המועמד, טיהור של NSCs, ואת היכולת להבחין NSCs מ צירופים. שיטה זו אורכת 13 ימים כדי לבצע, וזה של הרבהhorter מאשר השיטות הקיימות למנות תדירות המל"ל.
תאי גזע עצביים (NSCs) הם תאים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) שיכול עצמי לחדש והם multipotent. NSCs המפורט הראשון במהלך ההתפתחות של המוח הקדמי העוברי ולהמשיך להתמיד במוח הבוגר בבית לאזורים ספציפיים כגון אזור subventricular (SVZ) של החדרים לרוחב ואת gyrus המשוננת (DG) של ההיפוקמפוס. מספר קווי המל"ל נמצא בשימוש בניסויים קליניים לטיפול בשבץ ומחלות נוירולוגיות אחרות כמו מחל 1 של באטן.
NSCs ואת אבות עצביים (NPS) מופצים בתרבות צף מבנים אליפטית 3 ממדים שנקראים neurospheres. מערכת תרבות neurosphere פותחה על ידי ריינולדס וייס בתחילת 1990, כאשר הם מצאו כי תאי קליפת מוח עובריים ומבוגרים יכולים לחלק בנוכחות גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) ו גורם גדילה פיברובלסטים בסיסית (bFGF) 2-4. Neurospheres מורכב תערובת הטרוגנית של גאמות הכולל subclasses בשלבים התפתחותיים שונים 5. זה מאתגר במיוחד ללמוד NSCs באמצעות נתונים המתקבלים neurospheres בשל נוכחותם של צירופים. לפיכך, חשוב להעשיר NSCs מן neurospheres. כיום, ארבע שיטות עיקריות שימשו להעשיר עבור NSCs במבחנה. הראשון הוא השימוש סמנים פני התא. לואיס-X (לקס) ו CD133 (הידוע גם בשם Prominin1) הם פני התא הבולט המל"ל סמני 6-9. Syndecan-1, Notch-1 ו integrin-beta1 הם חלבונים משטח אחר המעשירים עבור NSCs 10. השני הוא הדרה לצבוע. הוכח כי התאים האוכלוסייה בצד, אשר יש את היכולת הייחודית לשאוב את צבע פלואורסצנטי ה- DNA מחייבת Hoechst 33342, מועשרים עבור NSCs 11. השלישי הוא השימוש של מיון המורפולוגי. הוכח כי תאים עם גודל תא גדל גרעיניות נמל יותר NSCs מאשר עמיתיהם 5,12,13. הרביעית היא תוספת של המל"ל suגורמי rvival עד בינוני התרבות. הוכח בנוסף לזה של proteoglycan כונדרויטין סולפט אפוליפופרוטאין E משפר הישרדות המל"ל ובכך מגביר המל"ל תדירה 14,15. למרות סמנים רבים, כולל גורמי שעתוק נקשרו NSCs 16,17, אף אחד הסמנים האלה מסוגלים להעשיר NSCs לטוהר. בשל חוסר סמנים המל"ל סופיים, זה עדיין מהווה אתגר לכמת NSCs ולהבחין ביניהם לבין צירופים במבחנה.
מחקרים ראשוניים השתמשו assay היווצרות neurosphere (NFA) לכמת NSCs 7,11,13. ב assay זה, תאים ניתקים הם מתורבתים כדי ליצור neurospheres ומספר neurospheres שנוצר עבור כל 100 תאים מצופים נקבע. ערך זה נקרא כמו יחידת גיבוש neurosphere (nfu). Nfu שווה את תדירות המל"ל אם כל neurospheres לנבוע NSCs. עם זאת, ניתן היה לראות כי nfu מגזים בהערכת תדירות המל"ל כפי neurospheres נוצרות על ידי שני NSCs ותחילת צירופים 5. לפיכך, אין זה מדויק למנות NSCs מבוססת אך ורק על היווצרות neurosphere. זה יכול להיות אפשרי לכמת NSCs מבוסס על יכולתם עצמית לחדש, להתרבות בהרחבה וליצור neurospheres multipotent.
NSCs, שהן EGF ו bFGF תגובה, בדרך כלל לשרוד במשך עשרה קטעים לפחות ובכך להציג יכולת התחדשות עצמית נרחבת בתרבות 4,18-20. צירופים, שהן EGF ו bFGF תגובה וכן, יכול גם ליצור neurospheres במשך כמה קטעים אבל לא במשך תקופה ארוכה של זמן. מכאן, זה כבר מקובל כי NSCs בתום לב אפשר למנות בדייקנות הוגנת מבוסס על היווצרות neurosphere במשך עשרה קטעים לפחות. במרבית המחקרים, לעומת זאת, התחדשות עצמית נמדד בדרך כלל מבוסס על היווצרות neurosphere שניוני ושלישוני בשל הזמן ניסיוני הרב הנדרש במשך עשר קטעים. לפיכך, NFA המשני יכול לשמש רחב להשוות את הימור יכולת התחדשות העצמיתאוכלוסיות Ween, אבל לא ניתן להשתמש בהם כדי למנות תדירות המל"ל במדויק.
NSCs יש יכולת שגשוג גדולה לעומת צירופים. מאפיין זה של NSCs שימש לואי ואח '. לפתח assay עבור ספירה המל"ל – את assay תא מושבת יוצרים העצבי (NCFCA) 21,22. ב assay זה, תאים בודדים בתרבית למשך 3 שבועות במטריצה חצי קשה המכיל קולגן. בתנאי התרבות אלה, זה היה מראה כי תאי יוצרי neurospheres מעל 2 מ"מ קוטר הם tripotent ויכולים עצמי לחדש לטווח ארוך. תאים אלה מוגדרים NSCs. לכן, NSCs נבדלים באופן יעיל מפני צירופים.
NSCs יש את היכולת להתמיין האסטרוציטים, oligodendrocytes נוירונים. לבידול של neurospheres, גורמי גדילה יוסרו בסרום מתווסף בינוני התרבות. אם כל שלוש השושלות עצביות הם נצפו בתוך neurosphere, ואז התא שיזם כי neurosphere iזה המל"ל. עם זאת, assay הבידול יש מספר מגבלות. ראשית, תנאי התרבות המשמשים לבידול לא יכולים להיות אופטימליים עבור דור של השלוש כל השושלות העצביות. למעשה, בתהליך התמיינות יחיד neurosphere, מוות של תאים משמעותי מתרחש בעיקר הדור astrocyte מתרחשת (Tham M ואחמד S, לא פורסם). שנית, יש את הנושא של clonality. עבור ספירה מדויקת של NSCs, היווצרות והבחנה של neurospheres צריכה להתבצע בתנאים משובטים, כאשר כל neurosphere עולה מתא בודד. בתרבויות ההשעיה בתפזורת, צבירה מתרחשת הן ברמות הסלולר neurosphere 23-25. לפיכך, זה אפשרי עבור כל neurosphere לנבוע מספר תאים או neurospheres, אשר מסבך ספירת neurosphere והערכת multipotency. הראיות אחרונות עולות כי צבירה של תאים אינה מתרחשת בצפיפות ציפוי נמוכה של 0.5 תאים / μL או מתחת, וכאשר צלחות תרבות אינן מועברות במהלך neurosphere היווצרות 15. לפיכך culturing תאים בצפיפות נמוכה כזה יבטיח clonality.
נכון לעכשיו, NCFCA היא השיטה הנפוצה ביותר להבחין NSCs מ צירופים ולפקידה תדירות המל"ל. NCFCA, לעומת זאת, דורש זמן רב יחסית של שלושה שבועות. כאן אנו מתארים פרוטוקול למנות תדירות המל"ל מבוססת על היכולת של NSCs לגבש neurospheres multipotent. פרוטוקול זה לוקח רק 13 ימים כדי לבצע. NCFCA מבטיח clonality כמו מטריקס קולגן מונע תנועה של neurospheres. תנאי התרבות להשתמש בפרוטוקול זה גם מאפשרים clonality כדי להישמר לאורך. למשל, השימוש 50-היטב תאי coverslips מבטיח כי neurospheres יבדיל בלי קשר לזה. יתר על כן, אנו משתמשים מותנים בינוניים המספקים גורמי neurotrophic במהלך התמיינות מנת למקסם את הפוטנציאל של בידול neurospheres (איור 1).
אנו מתארים הי הספירה של NSCs בתנאים משובטים. צעדים קריטיים לכלול את השימוש של מדיום גידול והבחנה טרי המל"ל, וגם שימוש פתרון PLL / Laminin מוכן טרי כדי לצפות את coverslips התאי, כמו גם את כלי התרבות. הדבר מבטיח תנאי גידול והתמיינות אופטימליים של neurospheres. שימוש נוגדנים באיכות טובה כדי לאתר את הנוירונים גליה ביעילות, כמו גם לקטיף סלקטיבית של neurospheres משובט כי אינם באים במגע עם neurospheres אחר, הם קריטיים. יתר על כן, חשוב להבטיח את neurospheres הרים לא להתייבש. מומלץ להוסיף 10 μL של מדיום בידול זה טוב לאחר קטיפתם כל 10 neurospheres. חשוב להשתמש coverslip אחד החדרים ב צלחת אחת 10 ס"מ לדגימה להימנע הצטלבות בין neurospheres ממדגמים שונים. אם שני coverslips (כל neurospheres המכיל בין מדגמים שונים) ממוקםאותו 10 ס"מ צלחת, neurospheres מ coverslip אחד יכול לשחרר גורמים שעשויים לשנות את הנטייה של neurospheres ב coverslip אחרים להתמיין שושלות ספציפיים. שני coverslips באותה 10 ס"מ צלחת עשויה גם לגרום בלבול בין דגימות.
במקרה ש nfu או תדירות המל"ל נמוך מהמצופה, להבטיח כי neurospheres מספר מעבר נמוך משמשים. כמו כן, חשוב כי neurospheres מעבר נמוך הבריא משמש להפקה בינונית מותנה. לאחר מכן, אם neurospheres מתורבתים בבארות עם קוטר קטן, כגון בצלחת 96-היטב, אז זה יהיה קשה לתמרן ולבחור neurospheres באמצעות micropipette. במקרה זה, להעביר את neurospheres לצלחת תרבות גדולה, כגון צלחת 6-היטב, לפני לקטוף. חלק מן neurospheres ההרים עשוי להמריא מן coverslip התאי במהלך תרבות immunostaining. צמצום התנועה של coverslip התאי במהלך התרבות, לשטוף אינטנסיבי פחותing במהלך immunostaining, יעזור למנוע ניתוק של neurospheres.
מחקרים ראשוניים לכמת NSCs רק באמצעות NFA 7,11,13. עם זאת, NFA מגזים בהערכת תדירות המל"ל הן NSCs ו NPS מוקדם ליצור neurospheres 5. לואיס ואח '. פיתח שיטה אחרת לכמת NSCs המכונה NCFCA 21,22. NCFCA כרוכה culturing תאים בודדים במטריצה מבוססת קולגן כדי להבטיח clonality, וזה היה מראה כי neurospheres מעל 2 מ"מ קוטר נוצרים על ידי NSCs בלבד. בדומה NCFCA, clonality מובטחת בכל פרוטוקול זה. זו מושגת על ידי יצירת neurospheres בצפיפות משובטת ובידול neurospheres ב coverslips התאי. השימוש התאי coverslips מקנה מספר היתרונות. את coverslip התאי מאפשר לכל neurosphere מדגם להבדיל מבלי מגע פיזי עם neurospheres מדגם אחר, ובכך להבטיח clonality במהלך התמיינות.את coverslip התאי ניתן למקם מושעה על מדיום הבידול לאפשר neurospheres המדגם להיות מותנה ברציפות כדי להבטיח בידול מקסימאלי. בהעדר בינוני בסרום המותנה במהלך התמיינות, הישרדות של neurospheres פוחתת neurospheres בעיקר ליצור האסטרוציטים (Tham M ואחמד S, לא פורסם). בנוסף, neurospheres immunostained ניתן לאחסן בנוחות תקופה ארוכה ואת coverslips התאי יכול להיות מותקן ישירות על שקופיות זכוכית מיקרוסקופ. בנוסף, הדמיה של neurospheres immunostained נעשתה קלה כאחד יכול במהירות לאתר את neurosphere הקטן תאי היטב, ללכידת תמונה, ולהמשיך הלאה אל באר הבא.
קבענו את התדירות המל"ל בתרבות neurosphere עכבר E14.5 הוא באמצעות הפרוטוקול המתואר בכתב היד הזה 27 ו NCFCA 28. תדירות המל"ל neurospheres העכבר E14.5 נקבע על ידי שני ליthods ניתן להשוואה. NCFCA מונה NSCs כי הם מולטיפוטנטיים יש יכולת התחדשות עצמית לטווח ארוך. מאז תדירות המל"ל מן השיטה שלנו דומה לזו מן NCFCA, את קריאת נתוני הפרוטוקול שלנו לא נראתה להעריך את התדירות המל"ל. NCFCA דורש שלושה שבועות להסתיים וכולל בעיקר ציפוי תא ומילוי בינוני. הפרוטוקול המתואר כאן דורש 13 ימים כדי לבצע וכרוך סדרות שונות של צעדים, למשל, קטיף neurosphere ו immunostaining. פרוטוקול זה יכול לשמש ככלי עזר אלטרנטיבה למנות NSCs. חוקרים יכולים להשתמש בשני NCFCA ופרוטוקול זה כדי לאמת תדירות המל"ל בדגימות שלהם.
מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא כי שורה של צעדים חשובים צריכה להיות כל שבוצעו ביום 8. הכנת הבינוני המותנה, קביעת nfu של neurospheres מדגם, והעברת neurospheres מדגם coverslip 50-היטב התאי צריך להיות שבוצע על דהy 8. אפשר לקחת את הזמן כדי להשלים את השלבים הבאים. בנוסף, זה דורש תרגול כדי לבצע שלבים אלה בצורה יעילה.
Neurospheres היה בשימוש נרחב כדי ללמוד לתפקד והתנהגות המל"ל. עם זאת, neurospheres מורכב הן של NSCs ו NPS. לפיכך, חשוב להעשיר NSCs מן neurospheres ללמוד ביולוגיה המל"ל. נכון לעכשיו, סמנים פני תא, רכוש הדרה לצבוע כמו גם גודל תא גרעיני שמשו להעשיר עבור NSCs 6,7,9-13,29,30. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לכמת את העשרת NSCs ידי סמני פוטנציאל המל"ל, וכדי להקל על החיפוש אחר סמן המל"ל מוחלט. ארבעה מחקרים שנעשו לאחרונה השתמשו בפרוטוקול זה למנות תדירות המל"ל 5,14,15,26.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים הסוכנות למדע, טכנולוגיה ומחקר (A * STAR), סינגפור למימון מחקר זה.
15 ml conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
50 ml conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
20 ml sterile syringe | BD | 300141 | |
50 ml sterile syringe | BD | 300144 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
Human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
1.0 N Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
Bovine serum albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
B27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
1x phosphate buffered saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
Cell culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
CO2 incubator | |||
Ventilated fume hood | |||
Aspirator | |||
Confocal microscope | |||
Micropipettes | |||
Micropipette tips | |||
Plastic pipettes | |||
Multichannel pipettes | |||
Glass beaker | |||
Sterile forceps | |||
pH meter |