Tasarım ve Düşük Maliyetli kullanımı, Otomatik Morbidostat Bakterilerin Adaptif Evolution için antibiyotik ilaç Seçimi Altında
Summary
We describe a low cost, configurable morbidostat that enables the characterization of antibiotic drug resistance by dynamically adjusting the drug concentration. The device can be integrated with a multiplexed microfluidic platform. The approach can be scaled up for laboratory antibiotic drug resistance studies.
Abstract
Biz antibiyotik direnci evrimsel yolu tanımlamak için düşük maliyetli, yapılandırılabilir morbidostat açıklar. morbidostat sürekli bakteri gelişimini izler ve dinamik onlar ilaç direnci elde etmek için geliştikçe sürekli bakteri meydan okumak için ilaç konsantrasyonunu ayarlayan bakteriyel kültür cihazdır. Cihaz ~ 10 ml çalışma hacmi bulunmaktadır ve tam otomatik ve optik yoğunluk ölçümü ve orta ve ilaç dağıtımı için mikro pompalar ile donatılmıştır. Platformu doğrulamak için, biz 1655 Escherichia coli MG trimetoprim direncinin aşamalı satın ölçüldü ve hücre morfolojisi ve antibiyotik duyarlılıklarının araştırmak için multiplekslenmiş mikroakışkan platformu cihazı entegre edilmiştir. yaklaşım antibiyotik ilaç direncinin laboratuvar çalışmalarına ölçekli yukarı ve metabolik mühendislik ve diğer bakteri kültürü deneylerinde gerilme geliştirmeleri için evrimi adaptif uzatılabilir olabilir.
Introduction
İlk antibiyotik ilaç penisilin tanıtılmasından bu yana, mikrobiyal antibiyotik direnci küresel bir sağlık sorunu 1 dönüşmüştür. Antibiyotik direnci elde edilmesi geriye in vivo olarak incelenebilir karşın, bu deneylerin koşulları genellikle bütün evrim 2 boyunca kontrol edilmez. Alternatif olarak, adaptif laboratuvar evrim bir antibiyotik ilaç 3'ten çevresel streslere veya seçim baskısı altında bir mikrobiyal türlerin moleküler evrim ortaya çıkarabilir. Son zamanlarda, antibiyotik ilaç direncinin çok iyi kontrol evrimsel deneyler antibiyotik ilaç direnci ortaya çıkmasını aydınlatmıştır. Örneğin, Austin'in grup düzgün tasarlanmış mikroakışkan bölmeli bir ortamda 4 hızlı çıkmasını gösterdi. Son zamanlarda geliştirilen morbidostat ilaç seçim baskısı 5,6 altında sistematik mutasyonlar neden olur. morbidostat, mikrobiyal SendaiSürekli neredeyse sabit nüfusu korumak için antibiyotik konsantrasyonunu ayarlar yon cihazı, mikrobiyoloji 7,8 kullanılan dalgalanma testi önemli bir ilerlemedir. dalgalanma testinde, bir antibiyotik ilaç yüksek bir konsantrasyonda enjekte edilir ve kalan mutantlar elenir ve sayılır. Bunun yerine, bir morbidostat içinde mikropların sürekli meydan ve çoklu mutasyonları elde edilir.
Morbidostat kemostat, mikrobiyal nüfusu 9 sulandırarak sırasında sürekli olarak besinleri sağlayarak sabit bir nüfus tutar 1950 yılında Novick'le ve Szliard tarafından icat bir kültür cihazına benzer çalışır. piyasaya sunulmasından bu yana, kemostat gelişmiş ve geliştirilmiştir. Güncel mikroakışkan chemostats nanoliter ve tek hücreli kapasiteleri ulaşmıştır. Bununla birlikte, bu cihazlar, bir çok mutasyon olayları 10,11 ile büyük hücre popülasyonunu gerektiren adaptif evrimi deneyler için uygun değildir. Son zamanlarda, mini~ 10 ml çalışma hacmine sahip chemostats da litre ölçek Biyoreaktörlerde ve mikroakışkan kemostat 12,13 arasındaki boşluğu doldurmak için geliştirilmiştir.
Burada bir antibiyotik ilaç direnci çalışma için tasarım ve düşük maliyet, otomatikleştirilmiş morbidostat sunuyoruz. Önerilen modül minimum donanım gereksinimi ile bir mikrobiyoloji laboratuvarında bir çalkalama inkübatör kullanılabilir. Açık kaynak yazılım aynı zamanda kolayca metabolik mühendislik 3 olarak adaptif evrim özel uygulamalar, için özel olarak tasarlanmıştır. Son olarak, morbidostat antibiyotik duyarlılık testi 14 için multiplekslenmiş mikroakışkan platforma entegre edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
düşük maliyetli bileşenleri Düşük ayak izi morbidostat cihaz gösterilmiştir. Cihaz tarafından kayıtlı ilaç direnç seviyesi artar önceki raporlarda 5 ile tutarlıdır. ilaç direnci evrimsel çalışmalar için tasarlanan cihaz, diğer birçok deneylere potansiyel uygulanabilir. İlk olarak, ilaç kaynaklı mutasyon Ayrıntılı bir klinik açıdan önemli antibiyotik büyük bir set için kurulabilir. Örneğin, çoklu ilaç direncinin evrimsel yolun sadece deneyde kullanılan ilaç sayısını…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Prof. Sze-Bi Hsu and Ms. Zhenzhen for useful discussions and help in the theoretical analysis and numerical simulation. Y. T. Y. would like to acknowledge funding support from the Ministry of Science and Technology under grant numbers MOST 103-2220-E-007-026 and MOST 104-2220-E-007-011, and from the National Tsing Hua University under grant numbers 103N2042E1, 104N2042E1, and 105N518CE1.
Materials
| Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
| Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
| 680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
| 100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
| 940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
| 940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
| Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
| 5V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5V supply voltage and 80mA available www.jameco.com |
| Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure >3kPa Flow rate >5 ml/min |
| Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
| Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4mm | |
| Glass scintillation 20ml vial | DGS | Pyrex glass 28mm(dia.)x 61 mm(h) | |
| Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
| Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
| Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
| Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
| Cadamino Acid | BD | Medium | |
| glucose | Sigma | ||
| Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
| Luria Bertani medium | |||
| Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use X40 objective NA=0.55 |
| Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
| Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
| USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
| Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs Max. Pressure 80 Psi |
| Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
| 1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
| Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
| NPN darlington transistor 500mA, 40V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
| 10kOhm, carbon film resistor, 0.25W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
| Tantalum capacitor, 10uF, 25V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
| Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
| ELISA plate reader | |||
| two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
| SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
| AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
| 20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
| Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
| DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
| Trimethoprim | Sigma | ||
| Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |
References
- Levy, S. B., Marshall, B. Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses. Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).
- Wang, M. M., et al. Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing. Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451 (2007).
- Dragosits, M., Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution – principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factory. 12, 64 (2013).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment. Science. 333, 1764-1767 (2011).
- Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).
- Toprak, E., et al. Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).
- Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time. Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).
- Young, K. In vitro antibacterial resistance selection and quantitation. Curr Protoc Pharmacol. , (2006).
- Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
- Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
- Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
- Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262 (2013).
- Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. , (2015).
- Mohan, R., et al. A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. . Nat. Protocols. 9, 1713 (2014).
- Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor. Biomicrofluidics. 9, 044126 (2015).
- Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. . Digital image using Matlab processing. , (2004).
- Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).
- Flensburg, J., Skold, O. Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim. Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).
- Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase. J. Biochem. 130, 439-447 (2001).
- Smith, D. R., Calvo, J. M. Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product. Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).
- Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology. Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).
- Cho, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Sci. Transl. Med. 17, 267 (2014).
- Hsu, S. B., Waltman, P. E. Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor. SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).
- Fu, W., et al. Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor. J. Biotech. 161, 242-249 (2012).
- Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting. Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).
