عالية الإنتاجية تحديد البكتيريا البوليمرات طارد للمستلزمات الطبية
Summary
A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.
Abstract
Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.
Introduction
والمنمنمة المجهرية البوليمر منصات عالية الإنتاجية التي تطبع حتى 7000 البوليمرات 1 على الشرائح الزجاجية لتحليل بالتوازي مع خلايا بدائية النواة أو حقيقية النواة 2. الطريقة المعروضة هنا يبني على ما وصفنا أولا في عام 2010 3. وقد طبق هذا النظام الفحص إلى العديد من أنواع الخلايا بما في ذلك خلايا الكبد البشرية 4، والخلايا الجذعية 5، الكلى الخلايا الظهارية أنبوبي 2، والبكتيريا والجراثيم 3،6 الأوالي 7. في كل حالة، تم تحديد البوليمرات التي تعزز أو تقاوم ملزمة للخلايا قيد الدراسة 8. كما تم استخدام المجمعات الحمض النووي مع البوليمرات الاصطناعية polycationic في شكل ميكروأري لفحص عالية الإنتاجية من المرشحين ترنسفكأيشن الجينات 9. وكذلك الكشف عن التفاعلات خلية الركيزة، كما تم استخدام المجهرية البوليمر لتقييم خصائص المواد 10.
"> القدرة البوليمرات الاصطناعية لتعديل المرفق من البكتيريا على سطح راسخة 3،6،11. وهناك عوامل عديدة بما في ذلك رسوم، للا مائية وخشونة سطح سطح البوليمر والمعروفة بتأثيرها، والأساليب التقليدية ملزمة البكتيرية الحيوية اكتشاف تقاوم ملزم من البكتيريا من خلال بالتتابع أو تصميم تجريبيا واختبار المواد في وقت واحد هي كثيفة العمالة ومكلفة والعمليات تستغرق وقتا طويلا. ميكروأرس بوليمر توفر بديلا جذابا للتحايل على هذه القيود.تنمو البكتيريا المرتبطة السطح كما يطلق عليه السكان معقدة بيوفيلم – هذه الأغشية الحيوية هي شديدة المقاومة للعديد من الضغوط البيئية والمضادات الحيوية. هذا ويرجع ذلك جزئيا إلى المصفوفة خارج الخلية كثيفة على (تتكون من البروتينات والسكريات والأحماض النووية) 12 ويرجع ذلك جزئيا إلى وجود زيادة قوية "persistor" الخلايا في الأغشية الحيوية 13. Althoلاف آليات دقيقة لجمعية السطحية وتشكيل بيوفيلم لاحق من الصعب توصيف ويعتقد عموما أن هناك ثلاثة مراحل مختلفة من النمو سطح 14-16. ويتبع الأولي، مرفق عكسها من خلال التصاق أقوى من الخلايا، وإنشاء بيوفيلم من إنتاج بروتين الخلية ومصفوفة السكاريد وتكاثر الخلايا. وأخيرا، فإن النشرات بيوفيلم ناضجة خلايا العوالق، والتي يمكن الشروع إصابات جديدة في أماكن أخرى خالية من يعيش. البكتيريا صد البوليمرات التي تحول دون التعلق الأولي من البكتيريا، وبالتالي منع المراحل المبكرة من تشكيل بيوفيلم، ويحتمل أن تمثل حلا ممتازا لتقليل العدوى. ونظرا لارتفاع مقاومة المضادات الحيوية (وكذلك مقاومة أكبر جوهريا من البكتيريا المرتبطة سطح 12)، وسائل مجانا المضادات الحيوية للحد من إصابات ذات أهمية خاصة. في المستشفى، البكتيريا صد البوليمريمكن الطلاء لها استخدامات الطبية المباشر في الحد من عدوى المستشفيات، والتي تشكل عادة الأجهزة حول زرع 17.
هنا، يتم وصف طريقة الإنتاجية العالية لفحص 381 البوليمرات لنشاط طارد ضد مجموعة من البكتيريا المسببة للأمراض المرتبطة عدوى المستشفيات، تليها التحقق من صحة ضرب وطلاء لاحق وفحص المواد القسطرة الوريدية المركزية، (الشكل 1). باختصار، كانت رصدت البوليمرات على الشرائح الزجاجية المغلفة الاغاروز عن طريق الطباعة الاتصال، وبعد التجفيف والتعقيم، وحضنت صفائف المنمنمة مع الثقافات البكتيرية مهمة سريريا. بعد الحضانة، وكانت ميكروأرس غسلها برفق وكانت ملطخة الخلايا البكتيرية ملتصقة وتصور من قبل مضان. وفي وقت لاحق، وقد تم التحقيق البوليمرات التي تحول دون بكتيريا ملزمة على نطاق أوسع من جانب طلاء على الزجاج غطاء زلات وتصور بواسطة المجهر الإلكتروني. صد مختارةثم تم المغلفة البوليمرات قدمت على القسطرة التجارية وأظهرت للحد من الحجز على البكتيريا عن طريق ما يقرب من 100 أضعاف.
Protocol
Representative Results
Discussion
الحب البكتيريا على سطح هي عملية معقدة تحددها مجموعة واسعة من العوامل التي تعتمد على الأنواع البكتيرية، وخصائص السطح، والوسط المحيط والبيئة المادية. وعلى الرغم من مجموعات كيميائية معينة المعروفة بتأثيرها البكتيرية ملزمة (polyglycols، على سبيل المثال، عادة مقاومة مرفق 11)، ربط الأثر البيولوجي للبوليمرات ذات البنية الكيميائية لهم أمر صعب، مما يجعل التصميم الرشيد من البوليمرات لمهام محددة الصعبة. في غياب آليات مرفق مفصلة، وقد حاولت دراسات أخرى لتقليد طبيعيا السطوح طارد، مع طويلة وتطويري مكثف يعالج 21. والمنمنمة طريقة الإنتاجية العالية المعروضة هنا يتغلب على هذه التحديات من خلال تسهيل الفرز الموازي للمئات من البوليمرات لتحديد يؤدي لمزيد من الدراسة.
نتائج من طريقة ميكروأري تكون أساسا لبيئة تطوير متكاملةntify المرشحين الرصاص المرجح الشكل 2 يوضح 22 مرشحا مع انخفاض ملزمة من نوع واحد على الأقل، في حين يوضح الشكل (3) انخفاض واضح في قدرة ملزمة. وقد تم نقل كل 22 البوليمرات منخفضة ملزم هو مبين في الشكل 2 إلى الأمام في التجارب على نطاق ويصل، تم خلالها تحديد أفضل (من حيث الصادة وطلاء خصائص) لتكون PU83، PA13، وPA515 (الأرقام 4 و 5). Polyacrylates توفر قدرا أكبر من المرونة من حيث أساليب البلمرة وهكذا تم اختيار polyacrylate أدنى ملزم، PA13، للدراسات القسطرة طلاء (أرقام 6 و 7). تم تنفيذ مزيد من العمل أكثر تفصيلا عن المرشحين الآخرين من وتم الإبلاغ عن أي مكان آخر 6.
من خلال عدد من التكرارات التجريبية وجدنا أن عددا من الخطوات الصغيرة مفتاح النجاح والتكاثر. فضلا عن تسهيل التصاقالبوليمرات على الشرائح الزجاجية، وذلك باستخدام الاغاروز تحت طلاء يوفر الخلفية نظيفة، كما الاغاروز شديدة المقاومة للاستعمار الجرثومي. وبالمثل الاتساق في البوليمر البقع أنفسهم، سواء داخل نفس المنظومة وبين المصفوفات، هو أمر حيوي، وبالتالي طباعة المصفوفات يجب أن تسيطر عليها بعناية. يطلب تعديل حذرا من المسامير في رأس الطباعة وملء أيضا موحد لوحة 384 جيدا لضمان اكتشاف موحد. وبعض من البوليمرات كنا أظهر درجة من تألق ذاتي، مع البيانات الأساسية مضان لكل شريحة قبل الحضانة مع البكتيريا الحيوية. لحساب الاختلافات والحصول على وينصح مكررات بيانات قوية من القطع الصغيرة.
وصمة عار يعملون هنا (دابي) لا يوجد لديه الانتقائية لأنواع البكتيريا، غير ملزم على وجه التحديد إلى الحمض النووي. لذلك، تقنية العقيم الجيدة ضرورية مرة يتم إدخال الثقافات البكتيرية كما الملوثات قد تمر مرور الكرام، الخلط بين interpreالكساء للنتائج. وينطبق الشيء نفسه على تجارب لاحقة باستخدام المجهر الإلكتروني، حيث أنه من الممكن فقط للتمييز بين قضبان ومكورات لكن ليس جنس أو الأنواع.
بعد الفحص ميكروأري، وينبغي اختيار البوليمرات واعدة لمزيد من التحقق من الصحة. في المثال المعروضة هنا، تم تحديد سبعة البوليمرات من الفائدة عن طريق الحد منها واضحا في مضان على ميكروأري وأكد تثبيط من الحجز عن طريق طلائها على الأسطح الكبيرة. أرقام 4 و 5 تظهر انخفاض ملزمة تحقق coverslips على الزجاج، ل وسائل عملية لاختبار سلوك البوليمرات مثل الطلاء الأكبر بدلا من البقع ميكروأري. وفي وقت لاحق، وقد تم طلاء هذه البوليمرات على الأجهزة الطبية لتحديد تماما انخفاض في التصاق البكتيريا. من المهم أن المذيب اختيار (انظر القسم بروتوكول 8) لهذه الدراسات طلاء غير حميدة على الركيزة المطلوب (هنا، القسطرة)، في حين تحتفظجي القدرة على حل البوليمر من الفائدة، من أجل السماح للطلاء. هنا، كنا الأسيتون التي، كما كذلك ذكر خصائص، لديه نقطة غليان منخفضة ويتبخر بسرعة لترك طلاء موحد.
وسائل التحقق من صحة اختياره سيعتمد على تطبيق معين قيد الدراسة. كما رصد الخلايا الإلكترون ومضان المجهر تسمح الكمي المباشر للمرفق الخلية الفردية، اخترنا هذه التقنيات كعنصر مكمل لمعظم فحص تلطيخ ميكروأري. وتظهر النتائج في أرقام 6 و 7، والتي تدل على أهمية أساليب التحقق من صحة مجانية. الصور مبائر في الشكل (6) توفر صور واضحة جدا من الخلايا الفردية، في حين أن وزارة شؤون المرأة له فائدة إضافية تتمثل في السماح للتقييم من سطح البوليمر، وهو هنا على نحو سلس وموحدة. تقتصر هذه الأساليب من مجال الرؤية من المجاهر المستخدمة، وبالتالي فمن importaNT إلى اتخاذ سلسلة من اللقطات لدينا ثقة في النتائج. الطريقة المذكورة أعلاه لا يمكن quantitate التقيد البكتيرية على سطح كامل، إلا الاستدلال على تغطية من عدد من المناطق الصغيرة. ونحن نعتقد أن هذا يكفي لتطبيق وصفها. يمكن تقييم انخفاض ملزمة البكتيرية بواسطة تعداد سطح البكتيريا الالتزام على القطع القسطرة المغلفة وغير المغلفة بأكملها باستخدام الأساليب كما هو موضح في مكان آخر (22). ولكن هذه الأساليب تتطلب السطوح بيولوجية فحص لديك مساحة موحدة، وهو أمر صعب للحفاظ عندما يتم تنفيذ المقايسات مع الأجهزة الطبية، والتي غالبا ما يكون الهندسة المعقدة.
ومن الواضح أن أي جهاز معد للاستخدام السريري يجب أن تذهب من خلال إجراء مزيد من التجارب كبير لضمان سلامة وفعالية في البشر. الطريقة المعروضة هنا يمثل بداية هذه العملية، وإلى مزيد من العمل يجب أن يتضمن تأكيدا لفي الجسم الحي النشاط. في هذه الحالة، ودراسة ج الوريديةatheters، يمكن العمل الأولي بالتحقيق في ربط مكونات الدم والخلايا الكاملة للبوليمر. وينبغي أيضا أن يؤخذ في الاعتبار تأثير مكونات الدم على ملزمة بكتيريا، وربما عن طريق تكرار المقايسات ملزمة في وجود المصل المعطل أو الدم دي fibrinated-23. وسيكون الاختبار النهائي للتكنولوجيا أن يكون في نموذج في الجسم الحي مثل نموذج عدوى الزرع تحت الجلد 24.
ونحن لشرح إمكانيات طريقة البوليمر ميكروأري لفحص البوليمرات أرض يغير. هذه البوليمرات (على حد سواء مقاومة وتعزيز بكتيريا ملزمة) لديها عدد كبير من التطبيقات في مجال الطب، وصناعة المواد الغذائية والتكنولوجيا الحيوية، وهذا يعني هذه الطريقة قد تكون مفيدة في العديد من المجالات البحثية. على الرغم من أن العمل هنا يستخدم البكتيريا، ويمكن تعديل هذه الطريقة لأنواع الخلايا الأخرى وغيرها من بالمثل ميكروأرس الكيميائية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank EASTBIO (the East of Scotland BioScience Doctoral Training Partnership funded by the BBSRC) (S. V.) and the Medical Research Council (P.J.G) for funding.
Materials
| Agarose | Sigma | 05066 | |
| Silane-prep slides | Sigma | S4651 | |
| Polymers | Synthesised in-house | Not applicable | |
| NMP | Sigma | 494496 | |
| LB Broth | Oxoid | CM1018 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma | 401757 | |
| (3-aminopropyl) triethoxysilane coated glass slides | Sigma | Silane-prep | |
| Cacodylate buffer | Sigma | 97068 | |
| Catheter 1 | Arrow International | CS12123E | |
| Catheter 2 | Baxter Healthcare | ECS1320 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 201030 | |
| Equipment | |||
| Contact printer | Genetix | Qarraymini | |
| Microarray microscope | IMSTAR | Pathfinder | |
| Spin Coater | Speedline Technologies | 6708D | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Image analysis software | Media Cybernetics | Image-Pro Plus | |
| Scanning electron microscope | Philips | XL30CP | |
| Sputter coater | Bal-Tec | SCD050 |
References
- Hansen, A., Mjoseng, H. K., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv. Healthc. Mat. 3 (6), 848-853 (2014).
- Tourniaire, G., Collins, J., et al. Polymer microarrays for cellular adhesion. Chem. Commun. (20), 2118-2120 (2006).
- Pernagallo, S., Wu, M., Gallagher, M. P., Bradley, M. Colonising new frontiers-microarrays reveal biofilm modulating polymers. J. Mat. Chem. 21 (1), 96-101 (2010).
- Hay, D. C., Pernagallo, S., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functionala hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Res. 6 (2), 92-102 (2011).
- Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22 (7), 863-866 (2004).
- Venkateswaran, S., Wu, M., et al. Bacteria repelling poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide) coatings for biomedical devices. J. Mat. Chem. B. 2 (39), 6723-6729 (2014).
- Pickering, H., Wu, M., Bradley, M., Bridle, H. Analysis of Giardia lamblia Interactions with Polymer Surfaces Using a Microarray Approach. Environ.l Sci. Technol. 46 (4), 2179-2186 (2012).
- Mizomoto, H. The Synthesis and Screening of Polymer Libraries using a High Throughput Approach. , (2004).
- How, S. E., Yingyongnarongkul, B., Fara, M. A., Díaz-Mochón, J. J., Mittoo, S., Bradley, M. Polyplexes and lipoplexes for mammalian gene delivery: from traditional to microarray screening. Comb. Chem. High Throughput Screen. 7 (5), 423-430 (2004).
- Thaburet, J. -. F., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromol. Rapid Commun. 25 (1), 366-370 (2004).
- Hook, A. L., Chang, C. -. Y., et al. Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment. Nat. Biotechnol. 30 (9), 868-875 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Evolving concepts in biofilm infections. Cell. Microbiol. 11 (7), 1034-1043 (2009).
- Lewis, K. Persister Cells. Ann. Rev. Microbiol. 64 (1), 357-372 (2010).
- Sauer, K., Camper, A. K., Ehrlich, G. D., Costerton, J. W., Davies, D. G. Pseudomonas aeruginosa Displays Multiple Phenotypes during Development as a Biofilm. J. Bacteriol. 184 (4), 1140-1154 (2002).
- Reisner, A., Haagensen, J. A. J., Schembri, M. A., Zechner, E. L., Molin, S. Development and maturation of Escherichia coli K-12 biofilms. Mol. Microbiol. 48 (4), 933-946 (2003).
- Watnick, P. I., Kolter, R. Steps in the development of a Vibrio cholerae El Tor biofilm. Mol. Microbiol. 34 (3), 586-595 (1999).
- Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. A review of the biomaterials technologies for infection-resistant surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8533-8554 (2013).
- Imstar. . Pathfinder Technology for High Content Cellular Screening in Cell Biology and Genetoxicity Software version: 6.04I. , (2012).
- Williams, J. R., Clifford, A. A. . Supercritical Fluid Methods and Protocols. 13, (2000).
- Kuo, J. . Electron microscopy methods and protocols. , (2007).
- Leslie, D. C., Waterhouse, A., et al. A bioinspired omniphobic surface coating on medical devices prevents thrombosis and biofouling. Nat. Biotechnol. 32 (11), 1134-1140 (2014).
- Bechert, T., Steinrücke, P., Guggenbichler, J. P. A new method for screening anti-infective biomaterials. Nat. Med. 6 (9), 1053-1056 (2000).
- May, R. M., Magin, C. M., et al. An engineered micropattern to reduce bacterial colonization, platelet adhesion and fibrin sheath formation for improved biocompatibility of central venous catheters. Clin. Transl. Med. 4, (2015).
- Chen, R., Willcox, M. D. P., Ho, K. K. K., Smyth, D., Kumar, N. Antimicrobial peptide melimine coating for titanium and its in vivo antibacterial activity in rodent subcutaneous infection models. Biomaterials. 85, 142-151 (2016).
