Se describe una metodología eficiente y simple para el análisis computarizado de comportamiento natatorio nematodos en líquido. El método requiere poca o ninguna inversión para C. elegans laboratorios. El hardware utilizado es estándar, y los programas de ordenador para el análisis del comportamiento (Celeste) es un código abierto uno.
La disección de los circuitos neuronales y neuromusculares que regulan el comportamiento sigue siendo un reto importante en la biología. El nematodo Caenorhabditis elegans ha demostrado ser un organismo modelo muy valiosa para ayudar a hacer frente a este reto, de inspirar enfoques tecnológicos, la construcción de la conectoma cerebro humano, de arrojar luz sobre realidad los conductores moleculares específicas de los patrones funcionales básicos. La mayor parte de los estudios de comportamiento en C. elegans se han realizado sobre sustratos sólidos. En forma líquida, los animales exhiben patrones de comportamiento que incluyen el movimiento en un rango de velocidades en 3D, así como los movimientos de partes del cuerpo, como un rizo posterior sin cambio de forma anterior, que introducen nuevos retos para la cuantificación. Las etapas de un procedimiento sencillo, y el uso de un software que permite el análisis de alta resolución de C. elegans nadar comportamiento, se presentan aquí. El software, llamado Celest, utiliza un programa informático especializado que realiza el seguimientovarios animales a la vez y proporciona nuevas medidas de C. elegans la locomoción en líquido (natación). Las medidas se basan en su mayoría en la postura de los animales y se basan en las matemáticas utilizadas en la visión por computador y reconocimiento de patrones, sin requisitos computacionales para el umbral de puntos de corte. La herramienta de software puede ser utilizado tanto para evaluar la destreza general nadar en cientos de animales de los ensayos pequeños lotes combinados y revelar nuevos fenotipos mutantes genéticos, incluso en bien caracterizados. La preparación de muestras para análisis con Celest es simple y de baja tecnología, lo que permite la adaptación de ancho por la comunidad científica. Por lo tanto, el uso del método de cálculo descrito aquí debe contribuir a la mejor comprensión de la conducta y circuitos de comportamiento en el modelo C. elegans.
Definiendo cómo el comportamiento de la genética, la epigenética, la experiencia y la influencia ambiente es un reto importante en la biología moderna. Los modelos simples, genéticamente susceptibles que pueden ser computacionalmente rastreados y medidos pueden hacer contribuciones importantes para alcanzar esta meta. Los nematodo Caenorhabditis elegans es uno de estos modelos. El propósito de este artículo es demostrar cómo C. elegans natación locomoción pueden ser rastreados y se cuantifica para extraer información sobre ocho nuevas características con relevancia biológica.
C. elegans tiene una vida útil relativamente corta de aproximadamente 2 – 3 w y un período reproductivo de aproximadamente 4 d a 20 ° C 1,2. En cultivos de laboratorio estándar, este nematodo microscópico se cultiva en placas de Petri que contenían Nematodo Medios de Crecimiento (NGM) que se propagan con una fuente alimentaria bacteriana 3,4. animales WT N2 se mueven activamente en las ondas sinusoidales elegantes en placas de agar-llenado; cambian rata movimientoes en itinerancia (búsqueda de alimento), la vivienda (navegación), o recuperándose de una comida (saciedad quiescencia inactivo) 5. Deterioro 6 ó 7-12 años de edad pueden alterar dramáticamente el movimiento de las placas.
Los genes que modulan el comportamiento, Healthspan o el envejecimiento, se pueden caracterizar funcionalmente por análisis de C. elegans los patrones de movimiento o locomoción. Un enfoque para medir healthspan es clasificar adultos mayores en tres categorías (por ejemplo, A, B, y C) de acuerdo con su locomoción en placas, con la actividad física vigorosa ser de clase A y parálisis ser de clase C 7,8,13. Aunque tal clasificación cualitativa es útil para revelar las diferencias en la forma física, las categorías son amplias y sin límites claros y por lo tanto su puntuación está sujeto a sesgo del experimentador.
Un número cada vez mayor de seguidores han elevado la objetividad, la sofisticación y la precisión del análisis del movimiento de C. elegansen medios sólidos de 14-18. C. elegans locomoción en placas se restringe principalmente al plano en el que el animal entra en contacto con la superficie sólida de los medios de comunicación. (C. elegans también puede inducir la exploración mediante el levantamiento de la cabeza del resto del cuerpo que todavía está en contacto con una superficie sólida, el posicionamiento del cuerpo en múltiples planos. Sin embargo, este comportamiento es inusual.) Cuando se coloca en un líquido, este nematodo inicia un movimiento ondulatorio, o la natación, que cuenta con más extenso movimiento dimensional, una mayor gama de velocidad y la profundidad de movimiento, y un aumento de la incidencia con la edad de movimiento anterior diferente a posterior en comparación con animales en superficies sólidas. Como un rápido análisis de la condición física y la respuesta al nuevo entorno, un experimentador puede colocar un animal individual en una gota de líquido y anotar la frecuencia de su cuerpo se dobla bajo el microscopio de disección. La grabación de vídeo puede facilitar scoring presentes y futuras de la natación el vigor de laanimal. Sin embargo, el enfoque manual de limitar el número de características que se pueden puntuar, y está totalmente restringido a punto de marcar un animal a la vez.
La locomoción en líquido ha sido menos explorada de la locomoción en medios sólidos. De hecho, hay pocas opciones de software que son robustos y fáciles de implementar en el laboratorio para medir la locomoción en líquido 19-24. El software de Celest (C. elegans prueba de natación) ofrece simplicidad de uso y las medidas matemáticos basados en los datos que entregan (puntuaciones de curvatura) directamente relacionadas con la naturaleza del movimiento 8; (descripción detallada de las características y ventajas en Restif et al. 8). Además, el análisis computacional permite la elucidación de las características fenotípicas que son imposibles para el ojo humano a marcar. En este caso, los datos que ejemplifican la resolución de este método de análisis se presentan y un fácil de poner en práctica el protocolo para grabar pruebas de nado se describe para el análisis posterior Célest.
El uso de C. elegans como sistema modelo sigue aumentando debido a su maleabilidad genética, la trazabilidad y la anatomía experimental anotadas, en detalle meticuloso. Por ejemplo, la estructura neuronal y la conectividad de la C. elegans hermafrodita está claramente trazaron 34-36, facilitando enormemente la investigación de los circuitos neuronales específicos que controlan conductas particulares. 302 neuronas constituyen el sistema nervioso del adulto hermafrodita, que procesar una amplia gama de entradas sensoriales en salidas de comportamiento básicas como la locomoción. La estructura del sistema nervioso más complejo masculina también se ha descrito 37, lo que permite circuitos sexo-específicas que deben abordarse. 37
C. elegans comportamiento ha sido ampliamente estudiado en placas de cultivo estándar que contienen medio sólido. Desde WT C. elegans se mueve en ondas sinusoidales previsibles en las placas de agar-llenado, las desviaciones de lapatrón general puede ser detectada por el ojo y obtuvo manualmente. Este enfoque, sin embargo, está sujeta a criterio del experimentador y mucha mano de obra. Herramientas de hardware y software diseñados para rastrear y medir C. elegans locomoción en medios sólidos eliminar el sesgo de subjetividad y permite estudios a gran escala, lo que permite cuestiones biológicas más sofisticados que deben abordarse. La base de datos del comportamiento reciente creado por el laboratorio Schafer 16 es un excelente ejemplo de la extensión y profundidad de análisis que se ha logrado con un sistema computacional para la locomoción en los platos.
Cuando WT C. elegans se coloca en forma líquida, el animal se adapta rápidamente su movimiento al nuevo entorno, iniciando un baño. C. elegans natación utiliza un mayor rango de movimiento que se arrastra y puede ser más irregular 8. Software como Célest pretende llenar el hueco para el análisis detallado de C. elegans comportamiento en estado líquido, permitting cuantificación de parámetros de movimiento asociado a que no se miden fácilmente por el ojo de la ONU con ayuda de, o que se pueden lograr con mayor rapidez que la calificación manual. En 8 h dura un individuo puede procesar hasta 200 videos, ~ 1.000 registros por día.
El software define parámetros que evalúan la natación que sirven como una huella digital completa de la condición física y el comportamiento. Además de enriquecer la comprensión de las complejas facetas de C. elegans comportamiento en el líquido y sus vías moleculares subyacentes, este software puede ser utilizado para explorar varios aspectos de la biología incluyendo respuestas farmacológicas, el envejecimiento, y el comportamiento distintos. Que aquí se presenta, el resumen de los cambios cuantificados que se producen en el rendimiento físico de C. elegans adultos, ya que la edad es un ejemplo de tal aplicación del software (para una descripción más detallada, ver Restif et al. 8). En el contexto del envejecimiento, algunos parámetros medidos disminuyeron mientrasotros aumentaron o no cambiar constantemente de tipo salvaje. Las tendencias se confirmaron en gran medida por el perfil de cálculo de los mutantes de la longevidad, y los perfiles relativos de cohortes ager agraciado y malos de las poblaciones de la misma edad mantenidos en condiciones ambientales uniformes. La alta resolución del software también puede revelar fenotipos sutiles previamente desconocido en los mutantes ampliamente caracterizados (por ejemplo, la edad-1 (hx546) en la Figura 1).
Hay algunos pasos particularmente críticos del protocolo descrito. El mantenimiento de un ambiente de temperatura constante entre el entorno de la piscina y el cultivo en placa de presión es importante para la reproducibilidad de natación, por lo que los experimentadores se les anima a ir a grandes esfuerzos para evitar los cambios de temperatura al azar. medios de natación deben estar a la misma temperatura que las placas. Del mismo modo, una cuidadosa atención al tamaño de la gota para el nado ayudará a asegurar la reproducibilidad. Por último, es prudente pensar enavanzar sobre la descarga de los archivos de video grandes que se acumulan. Se recomienda el procesamiento de imágenes en un sitio aparte del equipo de captura de vídeo.
El uso del software que aquí se presenta para el análisis de baño tiene ciertas limitaciones. En primer lugar, si bien los programas pueden rastrear simultáneamente múltiples animales, si hay más de cinco animales se analizan en conjunto, hay una mayor probabilidad de que los animales van a nadar a través de uno al otro en las imágenes de vídeo. Cuando el programa no puede determinar de forma inequívoca qué animal era que, según censura esas tramas de datos. Aunque esta característica programa asegura que los datos de los animales individuales son de alta calidad, que limita el rendimiento. En segundo lugar, las imágenes deben ser bastante limpio, que está libre de polvo, manchas y resplandor de las luces, como señales asociadas también pueden confundir el análisis de imágenes. Como se ha señalado en la sección 2.1.1 de protocolo, una inversión muy baja tecnología que puede ayudar en gran medida la captura de imágenes mediante la eliminación de las complicaciones con las fluctuaciones in ambiental de la iluminación es para cubrir el área del escenario con una tela oscura que no permite que la luz ambiente para llegar a la etapa. En tercer lugar, el programa está optimizado para los animales en la etapa adulta. Joven larvas nadan muy rápido y tienen cuerpos pequeños, lo que aumenta error del programa. En cuarto lugar, algunos de los software utiliza MATLAB, y cuando hay actualizaciones de versiones y / o actualizaciones del sistema operativo, algunos enlaces de programa puede ser interrumpido. Actualmente, el software está optimizado para su uso en MATLAB 2015b y Mac OS versión 10.10, pero esperamos pronto para publicar una versión de software que es más robusto frente a tales cambios. Por último, los archivos de datos de vídeo pueden llegar a ser grandes rápido, y requieren espacio de almacenamiento que ha de adjudicarse.
En resumen, se presenta aquí es una metodología sencilla que se puede implementar fácilmente por cualquier laboratorio sin mucha inversión para crear vídeos de C. elegans que nadan para el análisis Célest. Características del paquete de software incluyen una amplia automatización de seguimiento a través deanálisis, el seguimiento de múltiples animales simultánea, y el uso de bases matemáticas (es decir, medidas de curvatura) para la cuantificación de la mayoría de los parámetros de locomoción. El software es de código abierto, con código y demos a disposición del público como se detalla en Restif et al. 8. A pesar de que el programa cuenta con el análisis de la visión por ordenador avanzado de búsqueda, otros sistemas de seguimiento publicado (por ejemplo, Greenblum et al., 2014 38) son compatibles con el análisis de parámetros del software que aquí se presenta. Futuras mejoras serán dirigidos hacia convertir el software en un paquete más robusto que no restringe el uso de las versiones específicas de los sistemas operativos mencionados anteriormente (también indicados en la Tabla de Materiales).
The authors have nothing to disclose.
Celest desarrollo fue apoyado por el NIH subvenciones R21AG027513 y U01AG045864. Algunas representaciones de vídeo cortos de datos y se han adaptado de Restif et al. (2014) 8, que fueron publicados bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento (CC BY) http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Agradecemos a Ricardo Laranjeiro ayuda manuscrito.
REAGENT | |||
N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | C. elegans wild type (ancestral). | |
OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Biosafety Level: BSL-1. | |
OP50-1 Escherichia Coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Streptomycin resistant strain of OP50. Biosafety Level: BSL-1. | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
Printed Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 | have two etched 10mm diameter circles delineated by white ceramic ink |
Nematode Growth Medium (NGM) | For 1L: 17g Agar, 3g NaCl, 2.5g Peptone, 1mL 1M CaCl2, 1mL 5mg/mL Cholesterol in ethanol, 25mL 1M KPO4 buffer, 1mL 1M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
M9 buffer | For 1L: 3g KH2PO4, 6g Na2HPO4, 5g NaCl, 1mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
EQUIPMENT | |||
CeleST | Driscoll Lab, Rutgers University | C. elegans Swim Test | Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/ |
MATLAB | www.mathworks.com/downloads | MatLab version 2015b (best) | The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs. |
Mac OS | www.apple.com | Version 10.10 | Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab). |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
Transmitted Light Base | Diagnostic Instruments | TLB 3.1 | |
Digital CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12) | |
Digital Video Recording Software | Norpix | Streampix Version 3.17.2 |