This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.
与结构照明显微镜(SIM)光学超高分辨率成像是过程在化学和生物医学科学在分子水平可视化的关键技术。虽然商业SIM系统可供选择,这是定制设计在实验室中可以超越商业系统的系统,后者通常设计为易用性和通用应用,无论是在成像保真度和速度方面。本文介绍了一个深入的指南,构建一个使用全内反射(TIR)照明和能成像高达,分辨率达到了100纳米10赫兹三种颜色的SIM系统。由于SIM和TIRF的组合,该系统提供了比对手技术更好的图像对比度。为了实现这些规范,几个光学元件被用于使能在照明光的偏振状态和空间结构自动化控制可用于所有激励的wavelengths。给出了硬件实现和控制全部细节,实现与实现最大的采集帧率的重视激发光模式生成,波长,极化状态和摄像头控制之间的同步。一个一步一步的协议,用于系统校准和标定,并提出了可实现的分辨率提高是在理想的试验样品验证。用于视频率超分辨率成像的能力证明与活细胞。
在过去五年的时间,超分辨率显微镜已经成熟,并从专业光学实验室搬进了生物学家的手中。商业显微镜解决方案,实现光学超分辨率的三个主要变量有:单分子定位显微镜(SMLM),受激发射损耗显微镜(STED)和结构照明显微镜(SIM)1,2。 SMLM比如光敏定位显微镜(PALM)和随机光学重建显微镜(STORM)一直是最流行的技术,主要是由于光学装置的简单性和高空间分辨率的承诺,随手下降到20纳米。 通过单个分子本地化然而超分辨率显微镜附带的特性折衷:空间分辨率可达到依赖于积累足够数量的个别荧光本地化的,因此,限制了时间分辨率。成像动态过程因此在活细胞中的ES成为问题的,因为必须充分检验的感兴趣结构的运动,以防止运动伪影,而在这段时间来重建图像还取得足够的定位事件。为了满足这些要求,活细胞SMLM演示已经通过大大增加的激励功率得到在荧光光控速率所需的增加,这导致在轮到光毒性和氧化胁迫,从而限制样品存活时间和生物相关3。
受激发射损耗超过两个SIM和SMLM的明显优势是,它可以与超分辨率厚的样品中,对纳米左右60的例子的横向分辨率的图像在器官型脑切片在深度达到高达120微米4。在成像深度等与SMLM或SIM卡的单一目标的实现是不可行的,但能够用单分子的发光纸或点阵灯片话筒roscopy 5。视频速率STED还已经证明和用于映射突触小泡的流动性,尽管到目前为止已不限于成像的视图6小字段。
在细胞生物学和分子自组装反应7应用– 12需要与在许多时间点高时间分辨率成像,结构照明显微镜(SIM),可非常适合,因为它不依赖于特定的荧光的光物理性质探测。尽管SIM卡的这种固有的优势,到现在为止的使用一直主要局限于成像固定细胞或缓慢移动的过程。这是由于市售的SIM系统的限制:这些仪器的探测帧速率被用于产生所需的正弦照射样式以及偏振保持光学光栅的旋转速度的限制。最新一代的商业SIM卡仪器能够快速成像,但他们都贵得离谱所有,但中央成像设施。
这个协议提供了一个引导到柔性SIM卡系统的结构为薄的样品中并邻近活细胞的基底表面成像快速过程。它使用全内反射荧光(TIRF),以产生穿透深度不超过约150纳米到其中极大地降低了失焦背景信号的样品13的照明图案。 SIM卡的TIRF相结合的思想是几乎一样古老的SIM本身14,但没有2006年15之前通过实验来实现。第一体内图像与TIRF-SIM得到报告,2009年11赫兹的16实现帧速率来可视化微管蛋白和驱动蛋白动态,和两个彩色的TIRF-SIM系统已被提出17,18。最近一段时间,在建设和使用的单色双光束SIM个导ystem提出具有高达18赫兹19,20帧速率。
这里提出的设置是能够SIM超分辨率成像的在三种颜色,其中两个可在TIRF-SIM操作20赫兹。整个系统是围绕倒置显微镜帧构造和使用了电动XY平移台上用压电驱动Z台。以产生用于TIRF-SIM所需的正弦励磁模式,提出了系统使用的强电介质的空间光调制器(SLM)。二元光栅图案显示在SLM和所得±1衍射级进行过滤,中继和聚焦到物镜的TIR环。所需的相移和光栅的旋转被通过改变所显示的SLM图像施加。本协议描述了如何构建和调整这样一个激发路径,详细介绍了发射路径的排列,并给出测试样品,以确保最佳的调整。它还取消介绍了有关偏振控制和零部件同步的问题,并高速TIRF-SIM的挑战尤其如此。
设计考虑和约束
在组装该协议提出的TIRF-SIM系统之前,有几个设计约束考虑其中确定光学元件的选择。光学部件的所有缩写参见图1。
空间光调制器(SLM)
二进制铁电体的SLM在该设置中使用,因为它是能够亚毫秒级的图案的切换。可以使用灰度向列的SLM但这些报价大大减少切换时间。每个打开或关闭的像素的二进制相位SLM将赋予任一的π或0的相位偏移到入射平面波前,因此,如果一个周期光栅图案被显示在其上将作为相位衍射光栅操作在SLM。
ENT“>全内反射(TIR)以实现TIR并产生渐逝场,在玻璃样品接口的激发光束的入射角必须小于临界角更大的 。此设置所需的最小入射角,并因此也最大间距或周期,瞬逝照明图案。最大入射角 (接受角)是通过它可以从定义来计算物镜的数值孔径(NA)的限制 。这决定了最小图案根据阿贝式实现的间距哪个环节NA和波长到最小图案间距<imgALT =“公式”SRC =“/文件/ ftp_upload / 53988 / 53988eq6.jpg”/>。在实践中,1.49的NA油浸TIRF目标产生的左右79°入射和164纳米使用488nm的激发波长的样本的最小图案周期的最大角度。这两个角度限定在物镜的后孔径超过该仪器达到的TIR照明( 即在TIR环),并在其中两个激发焦点必须准确地定位并精确地转动,以产生各照明图案的环。
TIRF-SIM图像的重建需要的最低的每码形旋转三相移的获取,因此在SLM图案周期必须由3整除( 见图1)。例如,经过一段时间的9个像素为488纳米的照明和12像素为640纳米的照明。对于SLM的图案设计进行了全面讨论,包括使用剪切光栅间距模式的子像素优化见的Kner 等人 16和Lu-瓦尔特等 20 人,在两个励磁灶的位置的以前的工作必须在TIR环为所有波长内,然而,±1订单的衍射角从SLM是波长依赖。为标准的SIM,多色成像可以通过优化为最长波长的光栅周期,并且容忍为较短通道在性能上的损失来实现。对于TIRF-SIM然而,优化为一个波长意味着其他波长焦点是在TIR环内不再。例如,使用的9个像素的光栅周期是足以为488纳米提供的TIRF,作为焦点是在后面开口的及TIR环内直径的95%,但对于640纳米此期间将外定位病灶光圈。为此不同的像素图案间距必须用于每个激发波长。
的TIRF-SIM激发路径的取向在传统的SIM卡中的分色镜的位置,在镜身的微小变化(DM4 图1)极为敏感,远远超过了。不推荐的旋转滤波器立方体转台的使用,而是使用单一的,多波段分色镜,其被保持在一个固定的位置,并专门设计为使用的激发波长。至关重要的是,只有最高质量的分色镜被使用。这些要求中的至少厚3毫米基板,并且通常指定为“成像平面”制造商。所有其它基质导致的TIRF-SIM不可容忍像差和图像劣化。
偏振控制
实现的TIRF-SIM有必要与照明图案旋转同步的激励光的偏振态,使得其保持在目标光瞳平面方向偏光相对于光轴( 即。 s偏振光)。偏振控制光学对准,将取决于所用的具体的光学元件上,例如一个普克尔斯盒21,或半波片在一个机动化旋转台22。在这个协议中一个自定义的液晶可变延迟器(LCVR)时,设计成在波长范围提供全波(2π)延迟488至640纳米的,因为它允许快速(〜毫秒)切换。如果使用液晶延迟器,必须使用高质量的分量:标准组件通常不够稳定过的照相机曝光时间而引起的长度,得到恒定延迟模糊出照明图案和低调节对比度的。液晶延迟也强烈地依赖于温度,并且要求建在温度控制。
同步
激光器必须与SLM同步。二进制铁电SLM的是由s内部平衡开状态和关状态之间魔力。像素只有要么在帧间切换时间其打开或关闭状态,但不采取行动,如半波片。因此激光器只应在开/关状态通过在LED接通启用从SLM信号,以防止在图案对比度降低由于各像素的中间状态。声光调制器(AOM)也可选择使用作为快速快门如果激光器不能被数字调制。
镜头的选择
根据这些限制,以产生所需的在SLM平面的缩小到样品面上的期望的照明图案可被确定。这允许两个透镜L3和L4中的图像中继望远镜和激发聚光透镜L5的焦距的计算。在这个系统中的100X / 1.49NA油浸物镜使用具有488纳米和640纳米的激发,因此,使用300和140毫米焦距长度L4和L3,和300毫米L5,给人357X的总的缩小,相当于38毫微米在样品平面的SLM像素尺寸。使用的镜片这个组合,SLM光栅9周期为488纳米的照明和12像素为640纳米在样品给予的172和229纳米的图案间距,对应于分别为70°和67°的入射角。用于玻璃 – 水界面,临界角是61°,和是与波长无关,因此这两个图案间距允许两种波长的TIRF激发。或如果在37℃下操作装备有校正套环的物镜是用于通过在盖玻片的厚度变化引入的球差的校正是有用的。
影像重建
一旦原始SIM数据已经获取它的计算工作,以产生在一个两步骤过程的超分辨图像的问题。首先,照明图案具有用于待确定每一个形象其次,SIM频谱的组件必须分离,并适当地重新组合,以有效支持OTF(参见图6中的插图)的两倍。
投射照明图案的精确知识是至关重要的,因为超分辨频率分量必须是未混合的尽可能准确地防止由重叠部件的残余部分工件。我们确定照明图案参数从原始图像数据之后由Gustafsson 等人 23总之,一组照明参数描述归一化的二维正弦引入的过程后验已经为每个的发现激励模式 :
特此和形容条纹对比度分别开始的每幅图像M期的格局。波矢量的分量, 和 ,只有具有不同的取向变化图案和CAN的假设,否则不变。粗略地确定波矢量进行原始图像光谱的互相关,这是由施加子像素转移到交叉相关图像之一作为优化交叠精制的组件。这是通过真实空间相梯度做乘法这引起FRE子像素移位昆西空间。要注意的是,以前的实际图案推定具有波矢量的良好估计有用,这可以通过成像的荧光珠层中找到。
作为错开图案之间的相位的步骤是 即 。 ,频率分量的分离可通过傅立叶来执行沿着“相轴”变换。全球阶段和条纹对比度然后可以使用不同的组件的复杂的线性回归来确定。那么该个体分离的组分使用的是广义维纳滤波器相结合。广义维纳滤波器的两个参数提取和实现的详细说明,我们是指读者古斯塔夫森等 23其中使用相同的算法。
定制的TIRF-SIM系统,如在该协议中详述的设置在高速能够多色超分辨率成像相比市售显微镜。 SIM卡作为超分辨率技术的固有优点是,时间分辨率不被荧光团的光物理的限制,相对于其他方法,例如单分子定位显微镜(SMLM)或点扫描方法如受激发射损耗显微镜( STED)。与这些其他技术,SIM卡并不需要光开关或耗竭荧光所以多色成像非常简单。非TIRF-SIM系统,例如光学切片SIM和多焦点的SIM通常可以在实践中实现的1.7倍或更小的分辨率的改进,而不是2的改进这里所报告的因素,和商业系统也往往比系统慢和不灵活在该协议提出的。
“>在实施该技术的两个主要的困难是首先对目标的背孔,这需要费时费力光学对准过程的TIR区内六个SIM光束的精确定位的必要性。其次,以产生高图案对比度在样品中,偏振旋转是必要的。对于低NA 2D-SIM卡的系统,偏振旋转可以由线性偏振取向的仔细选择来避免,但这对于TIRF-SIM 25变得不可能。对于高速多色成像,电光偏振控制是必要的,这增加了系统的复杂性和费用。该技术的局限性
TIRF-SIM,像常规的TIRF,自然限于生物结构和位于基底细胞膜能够由消逝场的150-200纳米的穿透深度被照射的处理的观察。而SIM卡被经常引用作为是photodamaging细胞比任STED或SMLM,横向分辨率加倍确实还通过至少4倍5相对于传统的TIRF显微镜增加所需的光子数少。对于以短的曝光时间高帧速率成像,这种光子增加需要增加使用的照明强度。虽然任何荧光团可用于固定或缓慢移动的样品,高亮度的荧光蛋白质或具有增强的光稳定性下一代合成染料的SIM成像推荐用于活细胞成像。
虽然该实施方式是能够成像在超过20赫兹的SIM卡的帧速率的单一色的,在所提出的系统的多色成像是由机动发射滤光轮的开关时间的限制。由于大尺寸的SCMOS相机芯片,利用一个多频带发射滤波器和影像分裂光学器件将是可能的,并且允许同时我与没有速度处罚多个波长maging。另一种可能性是交替的不同的激发激光器和使用多频带的陷波滤波器来拒绝激发光。在该实施方式中使用的二进制铁电SLM的也不是最佳的。这样的SLM的衍射效率是非常低的,所以大部分的入射光是在零阶反射,其通过空间掩模过滤掉。对于要求非常高的帧速率的应用中,成像速度因此由激光二极管的输出功率的限制。在SLM还介绍了极化的波长从550纳米设计波长,其中象素不操作为理想半波偏振片远一些椭圆度。虽然这可以通过使用一个附加的LCVR进行补偿,提供了理想的解决方案可以是作为图案发生器使用数字微镜器件(DMD)的。
可能的修改
设置prese这里nted是柔性的,并且更容易比商用仪器,以便其他成像模态,例如3D-SIM卡,快速2D-SIM卡,多焦点的SIM(MSIM)和非线性的SIM(NL-SIM),可以实现21,34,35修改。
2D-SIM卡可以是适合于成像相对平坦的,快速移动的结构,例如作为外围内质网。外围ER由于其平面结构在于比可使用的TIRF倏逝场,但被照射在小区内更深可以使用标准的2D-SIM卡具有可忽略的失焦背景成像。此外,利用改进的光学切片重建算法来抑制失焦光延长使用2D-SIM的以光学厚的样品,虽然在不要求21轴向分辨率增加一倍。
在MSIM,样品被激发灶36的稀疏晶格照射。这种方式可以通过简单地除去空间掩模来实现(SM),并用偏振替换它。该SLM目前经营作为一个振幅调制器。在SLM上显示的二进制的SIM光栅可以通过斑点的二维晶格代替,以选择为等于在图像平面上的衍射受限的焦点的尺寸的斑点尺寸。在图7A中 ,4×4象素的正方形格子被显示在其上时缩小的样品上产生的150×150纳米衍射有限焦点在SLM(插图),给定的13.62微米的物理SLM像素尺寸。激发灶然后可以通过在SLM上的格子图案移位进行翻译,这是为了照亮的整个视场重复多次。图像被获取为每个翻译图案位置和堆栈后处理,得到具有改进的向上分辨率的重建图像以的系数并减少失焦光相比相当于广角图像30。这一方式可以是用于成像厚,致密的样品的量标准的SIM是不适宜,例如低对比度结构,例如染色的红血细胞( 图7C)是有用的,虽然采集时间由于增加的大量原料的帧每个视场必需的(在这种情况下,N = 168)。
最后,设置可以被修改,以使任一高NA线性TIRF-SIM或图案化活化非线性的SIM(PA NL-SIM),如Li 等人最近提出,通过使用超高1.7 NA物镜或添加的405nm的光活化激光和SLM光栅图形35的仔细的优化。
未来应用
SIM卡仍是一个迅速发展的技术,在生命科学的许多应用将在未来被启用。速度,分辨率和对比度的技术的改进和使用标准荧光团M的能力EAN,对于生物成像,SIM卡被设置为替代传统的许多显微镜系统,例如共焦和宽视场的平台。商业SIM系统如今已经可以与优秀的技术规格,但是,它们超出了许多研究实验室的金融范围,以及关键的是,他们是不灵活的修改和发展,以实现在该领域的最新研究进展。他们还缺乏必要的能力“被改编为实验在手”,经常在前沿生命科学研究的重要瓶颈。这里所描述的系统将特别适合于学习动态过程的细胞表面附近, 在体外重构双层系统的研究,以研究表面化学中的材料和物理科学, 例如 。的二维材料,以及许多其他应用。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由来自利华休姆信托,工程和物理科学研究理事会资助项目[EP / H018301 / 1,EP / G037221 / 1];阿尔茨海默氏症研究英国[ARUK-EG2012A-1];威康信托[089703 / Z / 09 / Z]和医学研究委员会[MR / K015850 / 1,MR / K02292X / 1]。我们分别感谢E. Avezov和M.鲁为LifeAct-GFP转染和细胞质-GFP的细胞,并W. Chen所准备HEK293文化。我们也感谢K. O'Holleran与显微镜的设计服务和L.邵R. Heintzmann有用的讨论和建议。
488 nm laser | Toptica | iBeam SMART | with digital modulation |
561 nm laser | Coherent | OBIS LS | with digital modulation |
640 nm laser | Cobolt | MLD | with digital modulation |
Long-pass dichroic mirrors | Thorlabs | for combining excitation beams | |
Quad band dichroic mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | 3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube |
Quad band dichroic mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | From same batch as above, 25 x 25 mm |
1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-860 | |
Glan-Taylor calcite polarizers | Thorlabs | GT5-A | For alignment of LCVR |
Glan-Taylor mount | Thorlabs | SM05PM5 | |
Achromatic half wave plate | Thorlabs | AHWP05M-600 | 400 – 800 nm |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1/M | For HWP |
Liquid Crystal Variable Retarder | Meadowlark Optics | SWIFT | Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm. |
LCVR controller | Meadowlark Optics | D3060HV | Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders |
Achromatic quarter wave plate | Meadowlark Optics | AQM-100-0545 | |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1P/M | For QWP |
10 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC080-010-A-ML | For beam expander |
200 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC254-200-A-ML | For beam expander |
Cage XY Translators | Thorlabs | CXY1 | |
Ferroelectric spatial light modulator | Forth Dimension Displays | M0787-00249 | SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1280 x 1024 pixels, with driver board |
SLM mounting frame | Forth Dimension Displays | M0787-10014 | Fixed to custom built aluminium mount |
Ø50.8 mm Gimbal Mirror Mount | Thorlabs | GM200/M | For SLM mounting |
Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform | Thorlabs | XYR1/M | For SLM mounting |
Rail carrier | Newport | M-PRC-3 | For SLM mounting |
Precision Optical Rail | Newport | PRL-6 | For SLM mounting |
300 mm achromatic doublet lens | Qioptiq | G322 273 322 | f = 300 mm, 31.5 mm diameter |
140 mm achromatic doublet lens | Qioptiq | G322 239 322 | f = 140 mm, 31.5 mm diameter |
Precision XY Translation Mounts | Thorlabs | LM2XY | |
Lens Mounting Adapters | Thorlabs | SM2AD32 | For mounting 31.5 mm lenses in 2" mounts |
Translation stages | Comar | 12XT65 | Dovetail, side drive |
XY Translator with Differential Drives | Thorlabs | ST1XY-D/M | for spatial filter |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1/M | for spatial filter |
300 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC508-300-A-ML | Excitation tube lens |
Automated XY stage with Z-piezo top plate | ASI | PZ-2150-XYFT-PZ-IX71 | with MS-2000 controller |
Inverted microscope frame | Olympus | IX-71 | |
Objective lens | Olympus | UAPON100XOTIRF | 100X/1.49NA |
High speed filter wheel | Prior Scientific | HF110A | with Prior ProScan III controller |
Bandpass emission filters | Semrock | FF01-525/30, FF01-676/29 | |
sCMOS camera | Hamamatsu | ORCA Flash v4.0 | |
Stage top incubator | OKO Lab | H301-K-FRAME | For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers |
Stainless steel optical posts | Thorlabs | TR series | for mounting optical components |
Post holders | Thorlabs | PH series | for mounting optical components |
Kinematic mirror mounts | Thorlabs | KM100 | for mounting 1" mirrors |
Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | |
100 nm fluorescent microspheres | Life Technologies | T-7279 | Tetraspeck |
Rhodamine 6G | Sigma Aldrich | 83697-250MG | |
8 well glass bottom dishes | ibidi | 80827 | with #1.5 coverglass |
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | with #1.5 coverglass |
0.01mm microscope reticle slide | EMS | 68039-22 | |
CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific | C10613 |