Met behulp van Light Sheet fluorescentiemicroscopie met Afbeelding zebravis Eye Development
Summary
Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.
Abstract
Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions.
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.
Introduction
Morfogenese is het proces dat het embryo en vormen samen met de groei en differentiatie drijft de ontogenie van een bevruchte eicel tot een volwassen meercellig organisme. Het morfogenetische processen tijdens dierlijke ontwikkeling kan het best worden geanalyseerd door beeldvorming van intacte levende exemplaren 1-3. Dit is omdat dergelijke gehele embryo beeldvorming behoudt alle componenten die drijven en ontwikkeling reguleren inclusief gradiënten van signaalmoleculen, extracellulaire matrix, vaatstelsel, innervatie en mechanische eigenschappen van het omringende weefsel. Om de weegschaal, waarbij morfogenese optreedt overbruggen, de snelle subcellulaire gebeurtenissen moeten worden vastgelegd op een minuut tijdschaal in het kader van de ontwikkeling van het hele weefsel dan uren of dagen. Om al deze eisen te voldoen, een moderne uitvoering 4 van de orthogonale vliegtuig verlichting microscoop 5 werd ontwikkeld. Oorspronkelijk werd het genoemd de Selectieve Plane Verlichting Microscopy (SPIM) 4; nu een allesomvattende term Light Sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM) wordt meestal gebruikt. LSFM maakt beeldvorming met een hoge tijdsresolutie, terwijl het induceren van minder fototoxiciteit dan laser scanning of draaiende schijf confocale microscoop 6,7. Tegenwoordig zijn er al veel implementaties van de basis lichtwaaier verlichting principe en het is gebruikt om een grote verscheidenheid van monsters en processen voorheen ontoegankelijke onderzoekers 8-11.
We zouden graag eerst een aantal belangrijke voordelen van LSFM ten opzichte van conventionele confocale microscopie benaderingen te benadrukken:
Zinvolle resultaten van levende microscopische beeldvorming experimenten te verkrijgen, is het belangrijk dat de waarneming slechts minimaal het monster beïnvloedt. Veel organismen zoals zebravis zijn zeer gevoelig voor blootstelling aan laserlicht, waardoor het moeilijk om deze afbeelding in een confocale microscoop met hoge tijdsresolutie zonder fototoxiciteit effecten zoals vastgelopen of vertraagde ontwikkeling 6,7. LSFM is momenteel de fluorescentie beeldvormende techniek met de minste verstoring van de het monster 7. Aangezien de dunne plaat laserlicht belicht alleen het gedeelte van het specimen dat wordt afgebeeld op een bepaald tijdstip, het licht plaat microscoop gebruikt fotonen zeer efficiënt. Bijgevolg is de lage blootstelling aan licht zorgt voor een langere time-lapse observaties van gezonder exemplaren, bijvoorbeeld 12-17. Verder dankzij de minimale invasiviteit van LSFM, het aantal verkregen beelden wordt niet meer bepaald door hoeveel licht het monster kan verdragen, maar door de hoeveelheid gegevens kan worden verwerkt en opgeslagen.
In dezelfde lijn van het houden van het model in de buurt van fysiologische omstandigheden, LSFM komt met alternatieve monster montage strategieën goed geschikt voor live-embryo's. In LSFM technieken worden de embryo's gewoonlijk ingebed in een dunne kolom lage percentage agarose. de mounting agarose in cilinders maakt de volledige vrijheid van rotatie, zodat het monster kan worden waargenomen vanaf de perfecte hoek (in LSFM aangeduid als view) en vanuit verschillende aanzichten tegelijk. De multiview imaging en de daaropvolgende multiview fusie is vooral gunstig voor grote, verstrooiing exemplaren en maakt het vastleggen van hen met een hoge, isotrope resolutie. Een overzicht van de andere mogelijke LSFM montage strategieën kunnen worden gevonden in de officiële microscoop handleiding, in het hoofdstuk over monstervoorbereiding geschreven door het lab van E. Reynaud. Het verdient aanbeveling lezen, vooral wanneer het doel is om het verschillende monsters als hier beschreven.
Het beeld acquisitie in LSFM is breed veld, camera-gebaseerde, in tegenstelling tot laser scanning confocale microscoop. Dit resulteert in een hogere signaal-ruisverhouding (SNR) voor de verkregen beelden en kan zeer snel zijn (tientallen tot honderden frames per seconde). De hoge gevoeligheid van LSFM maakt verdere beeldvorming van zwak fluorescerende samples, zoals transcriptiefactoren geuit op endogene niveaus 18 of, in de nabije toekomst, endogene eiwitten gelabeld met behulp van CRISPR / Cas9. De hoge SNR is ook belangrijk voor een succesvolle downstream beeldanalyse. De hoge snelheid is niet alleen noodzakelijk om snelle intracellulaire processen te vangen, maar ook het gehele beeld embryo uit meerdere weergaven snel genoeg. Een naadloze fusie van de verschillende standpunten kan alleen worden bereikt als de waargenomen verschijnsel niet veranderen tijdens verwerving van deze verschillende z stacks afkomstig van aparte uitzicht.
De voordelen van LSFM meestal niet ten koste van de beeldkwaliteit. De laterale resolutie van LSFM is iets slechter dan de resolutie van een confocale microscoop. Dit komt doordat de detectie doelen voor LSFM lagere numerieke apertuur (gewoonlijk 1,0 of minder) ten opzichte van 1,2-1,3 water of silicium immersie doelstellingen op standaard confocale setups. Bovendien, als gevolg van het brede veld detectie in LSFM (afwezigheid opce van een pinhole), is er meer out-of-focus licht in vergelijking met een confocale microscoop. Het bedrag van de out-of-focus licht wordt bepaald door het licht plaatdikte. Desalniettemin worden de nadelen gecompenseerd door de hogere SNR in LSFM. In de praktijk resulteert dit in soortgelijke kwaliteitsbeelden vergelijking met bijvoorbeeld draaiende schijf confocale acquisitie 15. Bijgevolg is dit maakt betrouwbare extractie van functies, zoals celmembranen of kernen, bijvoorbeeld voor cellijn tracing 15,19.
De axiale resolutie van LSFM wordt bepaald, naast de detectie doel, door het licht plaatdikte. De axiale resolutie kan LSFM in sommige gevallen overtreffen de resolutie van de confocale microscoop. Ten eerste, de verbetering van de resolutie komt wanneer de lichtwaaier dunner is dan de axiale resolutie van het detectiesysteem doel is meestal het geval voor grote preparaten afgebeeld met een doelstelling lage vergroting. De tweede manier, waarop de LSFM kan ACHieve betere axiale resolutie, is de multiview fusie, waarbij de hoge resolutie xy informatie vanuit verschillende standpunten wordt gecombineerd tot één beeld stack. De resulterende samengevoegde stapel heeft een isotrope resolutie naderen de waarden van de resolutie in de dwarsrichting 20,21. De strategie voor het registreren van de meerdere beelden op elkaar hier beschreven is gebaseerd op het gebruik van fluorescerende polystyreenkorrels als fiduciaire markers ingebed in agarose rond het monster 20,21.
Door de LSFM commercialisering deze techniek nu onder grote groepen wetenschappers 22. Daarom is de motivatie voor het schrijven van dit protocol is om deze technologie toegankelijk te maken ontwikkelingsstoornissen biologen weinig praktijkervaring in LSFM te maken en om deze wetenschappers begonnen met het gebruik van deze technologie met hun monsters. Ons protocol maakt gebruik van de commerciële licht plaat microscoop, die een conceptueel eenvoudige microscoop t vormthoed is eenvoudig te bedienen. We willen bovendien graag vermelden andere recente protocollen voor het afbeelden van de zebravis met zelfgebouwde LSFM setups, die geschikt zijn om bepaalde vragen te beantwoorden 23-25 zou kunnen zijn. Een andere optie om toegang LSFM zijn de open platforms 26,27, waarbij het open access principes gebruiken om het licht plaat microscopie om een bredere gemeenschap. De documentatie van zowel de hardware als de software aspecten is te vinden op http://openspim.org en https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/.
In dit protocol gebruiken we de beenvissen zebravis als een modelsysteem voor de ontwikkelingsprocessen met LSFM bestuderen. Morfogenese van de zebravisoog is een voorbeeld dat veel van de voordelen van LSFM onderstreept. LSFM is reeds in het verleden gebruikt om te onderzoeken ontwikkeling oog in medaka 28 en in de zebravis 29,30. In een vroeg ontwikkelingsstadium oog is ingewikkeld om het embryo juiste richting conventionele microscopie,als de omvangrijke dooier staat niet toe dat de embryo om aan de kant te liggen met zijn ogen geconfronteerd met de doelstelling. Echter, met LSFM inbouw in een agarose kolom, kan het monster reproduceerbaar gepositioneerd worden. Bovendien, bij de overgang van optische vesikel aan de optische kop fase het oog ingrijpende morfogenetische herschikkingen gepaard met groei, die vereist het vastleggen van een grote stapel z en een groot gezichtsveld. Ook voor deze uitdagingen LSFM superieur aan conventionele confocale beeldvorming. Het proces van vorming optische kop driedimensionaal, daarom is het moeilijk te begrijpen en uitsluitend visualiseren beeldvorming van een oog. Dit maakt multiview beeldvorming met isotrope resolutie gunstig. Na vorming optische kop, de retina steeds gevoeliger voor laserbelichting. Dus de lage fototoxiciteit geassocieerd met LSFM is een groot voordeel voor langdurige beeldvorming.
Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor beeldvorming van 1-3 dagen oude zebravis embryo eennd larven met de nadruk op het oog ontwikkeling. Onze methode maakt het vastleggen van time-lapse filmpjes met betrekking tot 12-14 uur met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Belangrijker laten we ook een pijpleiding voor gegevensverwerking, die een essentiële stap in LSFM, aangezien deze techniek altijd genereert grote datasets, vaak terabytes bereik.
Protocol
Representative Results
Discussion
1. Kritische stappen en probleemoplossing voor de data-acquisitie
De typische imaging instellingen voor een GFP en RFP expressie monster te vinden in Tabel 3. In de beschreven opstelling de microscoop lichtwaaier statisch, gevormd door een cilindrische lens. De twee verlichting doelstellingen zijn voorzien van lenzen en de detectie doel is een water-dompelen lens. Zoom 1.0 met 20X / 1.0 of 40X / 1.0 doelstellingen geeft 230 nm en 115 nm pixelgrootte en een gezichtsveld van 441 x 441 urn of 221 x 221 micrometer respectievelijk. Het wordt aanbevolen om de standaard licht plaatdikte gebruiken met het centrum verhouding 1 Rand: 2. Voor 20X / 1,0 deze dikte correspondeert met 4,5 urn en 40X / 1,0-3,2 urn in het midden. Als afbeeldingssnelheid niet de eerste prioriteit moeten gescheiden sporen bij een multicolor monster overspraak van fluorescentie-emissie tussen de kanalen te voorkomen. De hoogste snelheid van de overname is beperkt tot 50 msec per z stap voor debewegingssnelheid van de z-driver. Als het doel is om de maximale imaging snelheid te bereiken in het geval van, bijvoorbeeld, twee tracks met dubbelzijdige verlichting, de belichtingstijd moet worden ingesteld, zodat de som van alle genomen per z stap beelden is onder de 50 msec. Anderzijds, als één beeld per z stap wordt verkregen, is niet bevorderlijk voor de belichtingstijd korter dan 50 msec ingesteld.
| afbeelding 1920 x 1920 formaat |
| 16-bits |
| Pivot scannen op |
| Dubbelzijdige belichting met online fusion |
| 10X / 0.2 objectief verlichting |
| 20X / 1.0 W Plan-Apochromat detectie doel |
| Track 1: excitatie 488 nm normaal 2% van 100 mW laser, 550 nm SP emissie filter |
| Track 2: excitatie 561 nm meestal 3% van 75 mW laser, 585 nm LP emissie-filter |
| Belichtingstijd tot 100 msec |
| Z-stack dikte van 50-100 urn |
| 1-1,5 micrometer z stapgrootte in de continue z drive mode |
| Incubatie bij 28,5 ° C |
Tabel 3: Imaging-instellingen.
Het inspecteren van het monster na het experiment
Het is belangrijk dat het monster nog gezond aan het eind van het experiment. Als eerste uitlezing, controleer dan de hartslag van het monster onder een stereoscoop. Met een paar scherpe tang uit het monster kan worden genomen van de agar en verhuisde naar de incubator voor om na te gaan of het werd beïnvloed door de beeldvorming verder te ontwikkelen. Als alternatief kan worden vastgesteld voor antilichaamkleuring.
Montage en drift
Het is essentieel om de osmolariteit van de kamer houden waarinPLOSSING dichtbij de osmolariteit van de inbedding agarose, anders zwellen / krimpen van de agarose en daaropvolgende instabiliteit van het monster optreedt. Daarom gebruik maken van dezelfde oplossing (E3 medium zonder methyleenblauw) om de kamer te vullen en om de 1% laag smeltpunt agarose porties te bereiden. Bovendien, niet de agarose in 70 ° C verwarmingsblok reactie langer dan 2 uur, omdat het de gelerende eigenschappen kan verliezen.
Laat de vis niet insluiten in te heet agarose, omdat dit kan leiden tot een heat shock respons of de dood van het embryo. Bij twijfel over het effect van warm agarose op de embryo's, controleer dan of de staart niet buigen en dat de hartslag niet te vertragen. Als dit gebeurt, gebruik dan een andere embryo voor het experiment.
Houd de totale lengte van de agarose kolom met het monster kort (ongeveer 2 cm) en monteer de zebravis met zijn kop gericht op de plunjertop. Ook de agarose cylinder geëxtrudeerd uit de capillary zo kort mogelijk worden gehouden. Deze maatregelen zullen zorgen voor de stabiliteit van het monster in de hele film. Tegelijkertijd moet de agarosekolom lang genoeg zijn zodat de glazen capillair zich niet tot aan de lichtweg, aangezien deze belangrijke breking en reflectie zou veroorzaken.
De initiële drift van het monster wordt veroorzaakt door de volumeveranderingen van de agarose cylinder zelf. Glijden van de zuiger is niet de reden voor het. Daarom is het niet helpen om de plunjer met plasticine of nagellak op te lossen. Het embryo kan zijn positie in de loop van de film te veranderen als gevolg van de natuurlijke groei. Dienovereenkomstig is het raadzaam om het gebied van belang te centreren in het midden van het gezichtsveld en houden wat ruimte aan de randen van deze bewegingen tegemoet.
Verminderde hoeveelheid inbedding medium in het lichtpad
Oriënteren van de sample correct helpt om de best mogelijke beeldkwaliteit 15 bereiken. Genrally, excitatie en emissie licht moet reizen door zo weinig weefsel en montage media mogelijk. De optimale oplossing is agarose-montage. Dit gebeurde bijvoorbeeld in een opstelling voor Arabidopsis zijwortelinitiatie imaging 14, waarbij de hoofdwortel in Phytagel gemonteerd en de laterale wortels werden vervolgens laat volledig uit de gel kolom groeien. Agarose-montage werd ook ontwikkeld voor de beeldvorming van de volledige embryogenese van Tribolium kever over twee dagen 12. Beeldkwaliteit verbetering was geen primaire motivatie in dat geval. Tribolium embryo's gewoon niet lang genoeg overleven in de agarose. Een absoluut inbedding media-montage niet is bereikt voor de lange termijn beeldvorming in de zebravis. Toch kunnen we gebruik maken van het feit dat wanneer de agarose stolt, de meeste embryo schuin gepositioneerd in de capillair met een oog diep in de agarose en het tweede oog dicht bij het oppervlak van de inbedding kolom. Thij oog dichter bij het oppervlak zorgt voor een superieure beeldkwaliteit en moet daarom bij voorkeur worden afgebeeld.
Agaroseconcentratie en langdurige imaging
De concentratie van agarose voor de montage is een compromis tussen stabiliteit van het monster en de mogelijkheid om de groei van het embryo en diffusie van zuurstof te accommoderen. Er is geen extra toename in de stabiliteit van het monster bij gebruik van agarose hogere concentraties dan 1%. Als uitgangspunt voor het optimaliseren van de experimenten raadzaam 0,6% agarose, die ook geschikt is voor embryo's jonger dan 24 HPF die te fijn in 1% agarose te monteren zijn. Om oudere embryo's en larven verdoven, kan de MS-222-concentratie worden verhoogd tot 200 ug / ml zonder bijwerkingen 13.
Indien ontwikkelende embryo's worden afgebeeld langer dan ± 12 uur, agarose montage wordt afgeraden, omdat het de groei van het embryo en caus beperktes staart vervorming. Dit probleem werd opgelost door het monteren van de zebravis embryo's in FEP polymeer buizen met brekingsindex vergelijkbaar met water 13,39. Muizenembryo's, anderzijds, kunnen worden geïmmobiliseerd op agarose holle cilinders 40 of gaten van een acryl staaf bevestigd aan een injectiespuit 41. FEP buis montage wordt echter niet aanbevolen als standaard methode, omdat de wand van de buis breekt het licht iets meer dan agarose.
Light sheet alignment
Voor een goede beeldkwaliteit is het essentieel om de automatische licht blad uitlijnen voor elk experiment. Vooral als de zoominstellingen werden gewijzigd, werden de doelstellingen uitgenomen of een andere vloeistof die in de kamer.
Verlichting
Het draaipunt scannen van het licht plaat moet altijd worden geactiveerd. Voor grote verstrooiing specimens moet de dubbelzijdige belichting toepassing online fusion om gelijkmatige verlichting over het gezichtsveld te bereiken. Dubbelzijdige verlichting vermindert ook een specifiek probleem van het oog imaging, dat de breking van het binnenkomende licht door de lens plaat van het embryo. Kleinere, minder verstrooiende monsters efficiënt worden afgebeeld met behulp enkelzijdige verlichting, waarbij de beeldvormende verkort helft en kan leiden tot iets betere beeldkwaliteit in vergelijking met dubbelzijdige belichting. Dit komt omdat de lichtwegen van de belichting twee armen altijd anders en efficiënter kan worden gekozen. Daarnaast zijn de twee lichte lakens uit elke kant zijn nooit perfect in één vlak, wat mild oorzaken vervagen na de fusie. Voor zeer snelle intracellulaire gebeurtenissen, zoals de groeiende microtubuli (Movie 2), de dubbele eenzijdige belichting niet geschikt is, omdat de beelden met verlichting van links en rechts worden verworven na elkaar, wat kan resulteren in motion blur.
Photobleachingen fototoxiciteit
Minder fluorofoor fotobleken wordt vaak genoemd als een belangrijk voordeel van de LSFM. We beweren dat het doel geen fotobleken helemaal zou moeten zijn. Als er merkbaar fotobleken in de live-imaging experiment, het monster is waarschijnlijk al uit zijn fysiologische reeks verdragen blootstelling laser. Bij beeldvorming van de zebravis embryo's in de draaiende schijf microscoop, in onze ervaring, hoge fototoxiciteit kan embryonale ontwikkeling kraam nog voordat het fluorescerende signaal bleekmiddelen aanzienlijk. Daarom moet de beeldvormende instellingen in het LSFM aangepast zodat er weinig of geen fotobleken waargenomen. Hoewel LSFM aangenaam is voor het monster, is het verstandig om slechts zoveel laservermogen en blootstellingstijd als nodig is om een signaal-ruisverhouding voldoende is voor de latere gegevensanalyse bewerkstelligen.
Z-stack, tijdsintervallen en data-formaat
De bestanden die door LSFM zijn meestal erg groot; soms in de terabyte assortiment. Het is vaak nodig een compromis tussen beeldkwaliteit en gegevensgrootte maken. Dit is met name het geval voor z tussenruimte van stacks en intervallen in de time-lapse acquisities. Aan de z frequentie ervan, moet de optimale knop in de tab Z-stack instrument idealiter worden gebruikt, vooral als de dataset later wordt deconvolved. Het berekent de afstand tot 50% overlap tussen aangrenzende segmenten optische bereiken. Toch, wat grotere z intervallen zijn meestal aanvaardbaar. Ze verminderen de tijd die nodig is om de z-stack en de uiteindelijke bestandsgrootte verwerven. De optimale time sampling afhankelijk van het proces plaats. Voor algemene oogontwikkeling 5-10 min intervallen zijn meestal aanvaardbaar. Als sommige structuren automatisch worden bijgehouden, mag de latere tijdspunten gelijkaardig.
fluorescerende kralen
Fluorescerende kralen in de eerste plaats dienen als ijkpuntmarkers voor het registreren van verschillende weergavenvan een multiview dataset op elkaar. vortex altijd de kraal-oplossingen voor gebruik goed. Verwarm de kralen omdat dit kan leiden tot verlies van de fluorescerende kleurstof. De optimale concentratie voor de kraal multiview registratie moet experimenteel bepaald worden. De beschreven plugin werkt het beste met ongeveer 1.000 gedetecteerd kralen in elk oog. Groter (500 nm of 1000 nm) kralen steviger gedetecteerd dan kleinere (minder dan 500 nm) kralen. Dit komt doordat grotere kralen zijn lichter en gemakkelijker te segmenteren zonder vals positieve detecties van structuren in het monster. Het nadeel van de grotere korrels is dat ze zeer prominent in het uiteindelijke gesmolten en deconvolved beeld. Voor elke nieuwe fluorescente merker, de juiste korrelgrootte en fluorescentie-emissie te optimaliseren. Om een voorbeeld te geven van het monster uit figuur 5 en Movie 3, 100 nm groene emissie kralen gaven te veel vals positieve detecties in het membraan-GFP-kanaal, maar 1000 nm rode emissie parels werden robuust gedetecteerd in de H2B-RFP kanaal met zeer weinig positieve detecties in het monster. Als de kraal detectie mislukt in het kanaal met de fluorescente merker kan een afzonderlijk kanaal alleen die korrels worden verkregen, maar dit is niet erg praktisch. De sub-resolutie sized kralen geven directe uitlezing van de puntspreidingsfunctie (PSF) van de microscoop, die kan worden gebruikt voor deconvolutie (figuur 2C-D). Als de registratie en fusie beter met grotere kralen (bijv 1000 nm) werkt, kan een nieuw beeld van de PSF met sub-resolutie, bijvoorbeeld 100 nm kralen worden verworven. Het gebruik van multicolor kralen is nuttig tijdens de registratie van multichannel-acquisitie en voor het verifiëren dat de kanalen overlay perfect.
Toevoeging van fluorescerende kralen is niet noodzakelijk bij beeldvorming van één beeld zonder verdere multiview registratie en fusie. Maar zelfs in die gevallen kralen kan nuttig tijdens de Initia zijnl licht blad aanpassing om te controleren of de kwaliteit van het licht blad en in het algemeen optische aberraties te onthullen. Dergelijke optische aberraties kunnen afkomstig zijn van verschillende bronnen, zoals beschadigd of vuil doelstellingen, vuile ramen van de kamer of inhomogeniteit in de agarose. Kralen kunnen ook gebruikt worden voor drift correctie door de multiview registratie Fiji plugin 20.
Multiview
Voor de reconstructie multiview doel, is het beter om een oneven aantal views 3, 5 en dergelijke, die niet elkaar tegengestelde verwerven. Dit verbetert deconvolutie aangezien de PSF's worden afgebeeld vanuit verschillende richtingen. Het is ook belangrijk te bevestigen aan het begin van de tijdspanne verkrijging moet er voldoende overlap van de aanzichten. Dit kan het beste empirisch gedaan, dat wil zeggen, meteen bevestigd dat de standpunten in het eerste tijdstip met succes kan worden geregistreerd. Als het doel van de multiview overname is om de resolutie te verhogenvan een afbeelding van een grote verstrooiing specimen, is het niet raadzaam om beeld het volledige specimen in elke weergave, maar stoppen rond het midden van het monster, waarbij het signaal verslechtert. De lage kwaliteit overname uit de tweede helft van het monster zou nuttige informatie niet toe te voegen aan de multiview wederopbouw.
2. Kritische stappen en probleemoplossing voor de gegevensverwerking
Op dit moment bestaan er verschillende mogelijkheden voor het verwerken van multiview gegevens van een lichte plaat microscoop die goed zijn gedocumenteerd en relatief eenvoudig vast te stellen. We gebruiken de multiview wederopbouw van toepassing, dat is een open source software in Fiji 32 (Stephan Preibisch ongepubliceerde, geïmplementeerd Link 1a en Link1b in de lijst van materialen). Deze plugin is een belangrijke herontwerp van de vorige SPIM registratie plugin 20, beoordeelddoor Schmied et al. 42, de integratie van de BigDataViewer en de XML en hdf5 formaat 33 met de SPIM registratie workflow (Figuur 1B, Link 2 , Link 3 ). Deze toepassing kan ook worden aangepast voor high performance computing cluster, die aanzienlijk versnelt de verwerking 43. Deze multiview registratieaanvraag wordt actief verder ontwikkeld en steeds beter. In geval van problemen of functies verzoeken om de beschreven software, dient u problemen op de respectievelijke pagina's GitHub ( Link 4 voor Multiview Wederopbouw en Link 5 voor BigDataViewer).
De tweede optie is om de commerciële software gebruiken samen met de microscoop. Deze oplossing werkt goed en biedt werk aan hetzelfde principe met fluorescerende kralen om de verschillende standpunten registreren. Echter, het mist de mogelijkheid om de gehele dataset visualiseren snel als de BigDataViewer. Ook de software kan niet worden aangepast aan de cluster en bovendien de bewerkingsblokken de microscoop voor andere gebruikers zonder aanvullende licentie voor de software wordt aangeschaft.
De derde optie, die ook is een open source software, werd onlangs gepubliceerd door de Keller lab 44 en biedt een uitgebreid kader voor de verwerking en downstream-analyse van het licht plaat data. Deze software maakt gebruik van informatie vanuit het monster naar Multiview fusion voeren, daarom sluit de aanwezigheid van fluorescerende kralen om het monster nodig. Maar tegelijkertijd veronderstelt orthogonale oriëntatie van de standpunten imaging (doelen), dus het kan niet worden gebruikt voor data verkregen van willekeurige hoeken 44.
hardware vereisten
ntent "> De hardware voor verwerking kunnen worden in tabel 4. Er moet voldoende opslagcapaciteit en een duidelijke pijpleiding data processing, vóór de eigenlijke experiment. Overname van de afbeeldingen sneller dan daaropvolgende analyse en het is gemakkelijk te krijgen overspoeld met onbewerkte data. het is vaak niet realistisch om alle rAW-afbeeldingen, maar eerder een bijgesneden versie of bewerkte beelden op te slaan, zoals gefuseerde uitzicht, maximale intensiteit projecties of sferische uitsteeksels 45.| bewerker | Twee Intel Xeon processor E5-2630 (Six Core 2.30 GHz Turbo, 15 MB, 7,2 GT / sec) |
| Geheugen | 128 GB (16 x 8 GB) 1600 MHz DDR3 ECC RDIMM |
| Harde schijf | 4 × 4 TB 3.5inch Serial ATA (7.200 rpm) harde schijf |
| HDD Controller | PERC H310 SATA / SAS Concontroller voor Dell Precision |
| HDD Configuration | C1 3.5 inch SATA, 1-4 Harde Schijven |
| grafiek | Dual 2 GB NVIDIA Quadro 4000 (2 kaarten w / 2 DP & 1 DVI-I per stuk) (2 DP-DVI & 2 DVI-VGA adapter) (MRGA17H) |
| Netwerk | Intel X520-T2-poorts 10 GbE Network Interface Card |
Tabel 4: Hardware-eisen.
Verwerking van gegevens snelheid
De tijd nodig voor dataverwerking afhankelijk van de afmetingen van de data en de gebruikte hardware. In tabel 1, geven we een overzicht van de tijd die nodig is voor de belangrijkste stappen in de verwerking van een voorbeeld 8,6 GB multiview dataset die bestond uit 1 tijdstip met 4 x bekeken en 2 kanalen.
| Processing step | Tijd | Protocol stap |
| Opnieuw opslaan als hdf5 | 6 min 30 sec | 6.3 |
| Detect Interest Points | 20 sec | 6.4 |
| Inschrijven via interest punten | 3 sec | 6.5 |
| Content-based MultiView fusion | 4 hr | 7.2 |
| Multiview deconvolutie (CPU) | 8 hr | 7.3 |
| Multiview deconvolutie (GPU) | 2 uur | 7.3 |
Tabel 1: Data Processing Time.
Input data formaten voor multiview reconstructie
De Fiji Plugin Multiview Reconstructie kan ondersteunen .czi, tif en ome.tiff formaten. Door de gegevensstructuur van de .czi formaat discontinue datasets nietondersteund zonder pre-processing. Discontinue betekent dat de opname moest worden gestart (bijvoorbeeld de posities door drift van het monster passen). In dit geval moet de .czi bestanden worden opnieuw opgeslagen als .tif. Voor tif-bestanden elke weergave en de verlichting richting moet worden opgeslagen als een apart bestand.
Kalibratie van pixelgrootte
De microscoop-besturingssoftware berekent de kalibratie van het xy pixelgrootte op basis van de geselecteerde doelstelling. Echter, de pixelgrootte in z onafhankelijk bepaald door de stapgrootte. Als een verkeerde doel is opgegeven in de software van de xy tot z ratio is onjuist en de registratie zal mislukken.
Eerste registratie
Na het definiëren van de dataset van het aantal registraties zal zijn 1 en het aantal rente punten zal zijn 0 in de ViewSetup Explorer. De eerste inschrijving geeft de kalibratie van de dataset. Zowel het aantal of registraties en interesse punten zal toenemen tijdens de verwerking.
Onderaan de bemonstering voor de detectie van rente punten
Via downsampling wordt aanbevolen, aangezien het laden van de bestanden en segmentatie zal veel sneller. Het is echter belangrijk om op te merken dat de detectie parameters zal veranderen, afhankelijk van de bemonstering, waardoor detectie-instellingen overbrengen tussen verschillende neer monster instellingen is niet mogelijk.
Detectie van rente punten
Het is raadzaam om segment zoveel echte parels mogelijk in elke weergave, zelfs bij de prijs van het verkrijgen van een aantal vals-positieve detecties, omdat zij de inschrijving niet wezenlijk niet hinderen. Onechte detecties, als klein in aantal, zijn uitgesloten tijdens de registratie (zie Registratie van rente punten). Echter, massieve vals positieve detecties vormen een probleem voor het algoritme. Het vermindert niet alleen prestaties voor de detectie ende registratie, want het duurt veel langer om het segment van de afbeelding alsmede vergelijken deze kralen tussen het uitzicht, maar het vermindert ook de nauwkeurigheid van de registratie. Dit kan worden aangepakt door strengere detectieparameters. Bovendien, op segmentatie van de kralen (dwz meerdere detecties op een kraal Figuur 1E) nadelig is voor de registratie en moet worden vermeden.
Registratie van de rente punten
Naar de standpunten op elkaar te registreren, wordt de locatie van elke kraal in elke weergave beschreven door zijn positie ten opzichte van de drie dichtstbijzijnde naburige kralen. Deze sterrenbeelden zijn de vorming van een lokale geometrische descriptor en laat het vergelijken van elke kraal tussen de standpunten. Kralen met bijpassende tem tussen twee visies worden dan beschouwd als kandidaat-correspondenties. Merk op dat dit alleen werkt voor willekeurig verdeeld kralen, waarbij de lokale descriptoren typisch uniek voor elke kraal.Men kan andere structuren gebruiken, zoals kernen in het monster voor registratie. Echter, om kernen, die niet willekeurig verdeeld in het monster detecteren, andere methoden toepassen 20,21.
De kandidaat correspondenties worden vervolgens getoetst aan RANSAC 36 om valse positieven te sluiten. Elke correspondentie suggereert een transformatie model voor het bedekken van het uitzicht op elkaar. True correspondenties zou waarschijnlijk het eens over een transformatie model, terwijl uitschieters zou elk punt naar een ander. De ware overeenkomsten worden vervolgens gebruikt om een affiene transformatie model tussen de twee vergeleken uitzicht berekenen. Een globale optimalisatie met een iteratieve optimalisatie algoritme wordt dan uitgevoerd, waarbij alle uitzicht op het eerste zicht, met als doel een minimale verplaatsing tussen de standpunten 20,21 zijn geregistreerd.
Time-lapse registratie
Door verplaatsenling van de agarose en onnauwkeurig motoriek van de microscoop podium, de positie van elke stapel matig varieert in de tijd. Overwegende dat de registratie van de individuele tijdstip het verschil tussen de standpunten van dit tijdstip verwijdert, de time-lapse moet ook in zijn geheel te worden geregistreerd. Hiertoe wordt elke afzonderlijke tijdstip geregistreerd op het referentietijdstip.
Referentie tijdstip
Als een tijdreeks met verschillende tijdstippen wordt verwerkt, wordt een representatief tijdstip als referentielijnen gewoonlijk vanuit het midden van de tijdreeks omdat de kraal siteiten tijd versleten door bleken. Op deze referentie kunnen de parameters voor rente punt detectie, registratie, inbinden en fusie worden bepaald. Deze parameters worden dan toegepast op het hele tijdsverloop een specifiek transformatiemodel voor elk tijdstip te berekenen. Tijdens de time-lapse registratie alle andere tijdstippen zijn ook regEred ruimtelijk op deze referentie tijdstip. Dus het selectiekader parameters voor de gehele opname zijn afhankelijk van deze specifieke tijdstip.
multichannel registratie
Wanneer beeldvorming meerdere kanalen, idealiter dezelfde fluorescerende kralen moeten zichtbaar in alle afgebeelde kanalen. De detectie en registratie kan dan worden uitgevoerd op elk kanaal afzonderlijk, waarbij de invloed van de verschillende golflengtes van het licht op de omzetting rekening houdt. Vaak is dit niet mogelijk, omdat de korrels niet zichtbaar in alle kanalen of kralen domineren het beeld te veel in één kanaal en zijn te zwak in het andere kanaal (s). De typische oplossing is om kralen zichtbaar is uitsluitend te gebruiken in een kanaal voor de detectie en registratie en de verworven transformatie model (dat wil zeggen na detectie, registratie en time-lapse registratie), dan wordt toegepast op de andere kanalen door Fiji> Plugins> Multiview Reconstruction> Batch Processing> Extra> Duplicate Transformations. In het drop down menu voor Toepassen transformatie van Selecteer één kanaal naar andere kanalen. In het volgende venster selecteert u de XML en klik op OK. Selecteer vervolgens het kanaal dat de kralen bevat als Bronkanaal en zoals Target kanaal van de zender (s) zonder kralen. Voor Duplicate die transformaties gebruiken Vervang alle transformaties en druk op OK. De transformaties worden dan gekopieerd naar alle andere kanalen en opgeslagen in de XML. Om de nieuwe veranderingen in de ViewSetup Explorer te zien, start u de MultiView Wederopbouw Application.
selectiekader
De fusie van meerdere weergaven rekenkundig zeer intensief. Echter worden grote afbeeldingen meestal verkregen niet alleen het monster, maar ook de kralen om hierop in. Zodra de registratie parameters worden uit de kralen, ze niet meer bruikbaar zijn als deel van het beeld. Daarom, om de efficiëntie van de fusie te vergroten, worden alleen de gedeelten van de afbeeldingsstapels met het monster samen te smelten. Een regio van belang (bounding box) moet worden gedefinieerd om het monster te bevatten en zo weinig van de omringende agarose mogelijk. Voor het voorbeeld in figuur 2 een gewogen gemiddelde fusie op het gehele volume met 2229 × 2136 × 2106 px 38.196 MB RAM nodig zou zijn, terwijl bij een selectiekader het volume is gereduceerd tot 1634 × 1746 × 1632 px en de herinnering eisen worden verminderd tot 17.729 MB.
Content-based MultiView fusion
De uitdaging in het fuseren van multiview gegevens is dat het uitzicht meestal eindigen abrupt en hebben niet dezelfde beeldkwaliteit voor dezelfde voxels bevatten. Eenvoudige middeling van het uitzicht zou dus leiden tot het mengen van artefacten en onnodige beeld degradatie. Content-based MultiView fu sie neemt beide problemen rekening. Ten eerste, mengt de verschillende aanzichten, waarbij een beeld eindigt en de andere begint en anderzijds het DG de lokale beeldkwaliteit en geeft hogere gewichten hogere beeldkwaliteit in het fusie-21. Vergeleken met één beeld is een verbetering van de resolutie z met een lichte verslechtering van het signaal in xy (figuur 2E-H, Figuur 5A-D).
Multiview deconvolutie
Multiview deconvolutie is een andere benadering van de fusie van het uitzicht te bereiken. Met deze methode ook de PSF's van de verschillende standpunten in aanmerking worden genomen om het beeld dat is convolved door de optiek van de microscoop te herstellen. Deze methode verbetert drastisch de beeldkwaliteit door het verwijderen van beeldonscherpte en het verhogen van de resolutie en het contrast van het signaal 31 (figuur 2C-D, Figuur 2I-J, figuur 5E-G, Movie 3).
ve_content "> Deconvolutie rekenkundig zeer intensief (zie tabel 1), waardoor het gebruik van een GPU voor de verwerking verhoogt de snelheid van dit proces. Het kan ook nodig zijn om de deconvolutie uitvoeren naar beneden bemonsterde gegevens. Om af te monster, gebruiken Fiji> Multiview Wederopbouw > Batch verwerking> Extra> Breng Transformations. Dit zal een nieuwe transformatie model toe te passen op de standpunten die in het XML-bestand wordt opgeslagen.Hdf5 bestandsformaat voor BigDataViewer en BigDataServer
De BigDataViewer 33 maakt een eenvoudige visualisatie van terabyte-sized data. Hoe de BigDataViewer controle is samengevat in tabel 2. Een screencast van de fundamentele werking van het programma is ook beschikbaar als een aanvulling in de oorspronkelijke publicatie 33. De BigDataViewer is gericht op een XML-bestand, waarbij de metadata bevat, en een hdf5 bestand, dat de beeldgegevens bevat. De beeldgegevens zijn present in de hdf5 in verschillende resolutie niveaus in 3D-blokken. De meervoudige resolutie niveaus zorgen voor het visualiseren van de gegevens sneller met een lagere resolutie, voor de volledige resolutie is geladen. Individuele blokken worden alleen in het geheugen geladen wanneer nodig. Zo is het beeld hdf5 formaat maakt directe en snelle visualisatie van de gegevens via het BigDataViewer 33. Het versnelt ook verwerken aangezien het laden van de bestanden efficiënter plaatsvindt. Daarom raden we opnieuw op te slaan van de dataset in dit formaat, hoewel het niet strikt noodzakelijk is voor de verwerking. Voor nadere toelichting op de dataformaat, verwijzen wij u naar Link 3 . Daarnaast kan de datasets worden gedeeld met medewerkers of het publiek met behulp van de BigDataServer 33 ( Link 6 ).
| sleutel | <td> effect|
| F1 | toont de Help met een korte beschrijving van de BigDataViewer en de basiswerking |
| <> Of muiswiel | beweging in de z |
| pijl omhoog en omlaag | in- en uitzoomen |
| klik met de rechtermuisknop en slepen | beweegt monster in de kijker |
| links klikken en slepen | roteert monster rond de cursor |
| schuifknop aan de onderkant van de kijker of Tab en pijl links of rechts | beweegt op tijd as |
| Daarnaast drukken shift | snellere beweging of rotatie langs elke as |
| x en dan links en pijl naar rechts | draait rond de x-as |
| y en dan links en pijl naar rechts | draait rond de y-as |
| z en dan links en pijl naar rechts | draait rond de z-as |
| shift en x | oriënteert het uitzicht langs de x-as |
| shift en y | oriënteert het uitzicht langs de y-as |
| shift en z | oriënteert het uitzicht langs de z-as |
| ik | schakelt tussen de verschillende interpolatie modi (dwz de dichtstbijzijnde buren en trilineaire) |
| s of Instellingen> Helderheid en contrast | wijzigt de kleur van de kanalen, helderheid en contrast |
| F6 of Instellingen> Zichtbaarheid en groeperen | verandert de weergegeven groepen, stelt groepering te overlappen verschillende groepen en het aanroepen van de groepen via de cijfertoetsen |
| F10 of Extra> Record Movie | verkrijgt een tijdreeks van de momenteel weergegeven slice |
Tabel 2: Big Data Viewer.
3. Beperkingen van de beschreven uitvoering van LSFM
low throughput
In een typisch LSFM experiment slechts één monster per experiment wordt afgebeeld. Nog steeds, in onze ervaring, een veel nuttige informatie kan worden gewonnen uit dat enkel monster. Hoge doorvoer beeldvorming van meerdere embryo is recentelijk op zelfgebouwde LSFM setups 46-48, hoewel gewoonlijk ten koste van vrijheid monster positionering en rotatie.
Onvoldoende penetratie diep in de weefsels
Terwijl zebravis embryo doorschijnend, wordt de verkregen beeldkwaliteit verslechtert snel bij beeldvorming dieper in het weefsel door verstrooiing en absorptie. Gedeeltelijk is dit een gevolg van verstrooiing en absorptie van de uitgestraalde fluorescentie van het monster en kan in de huidige opstelling worden gecorrigeerd. Een andere bron van ongelijke beeldkwaliteit onregelmatige verlichting. THij licht sheet invalt vanaf de linker- of rechterkant en voorwerpen in zijn pad breken het, wat resulteert in een streep artefacten en onscherpte. De dubbelzijdige verlichting en multiview fusie kan de artefacten in het uiteindelijke beeld te verminderen. Tenslotte de beeldkwaliteit is meestal iets slechter aan de rand van het gezichtsveld het gevolg zijn van de natuurlijke geometrie van het licht plaat, die steeds dikker naar de randen.
Limited chemische manipulatie
Het gebruik van drugs of remmers is wijdverbreid in de zebravis onderzoek. In deze microscoop drugsgebruik is beperkt vanwege het grote volume van de monsterkamer en overwegingen van gebruikers van het instrument, die de kamer delen. Met behulp van een extra kamer gewijd aan drugs experimenten kan dit probleem op te lossen. Vullen van de kamer gedeeltelijk met glaskralen vermindert de hoeveelheid vloeistof die nodig is.
geen photomanipulation
CurrenTLY is er geen mogelijkheid van gelokaliseerde optische manipulatie zoals photoconversion, of laser ablatie in deze microscoop. Toch kan zelfgebouwde opstellingen worden gebruikt voor dergelijke specifieke toepassingen.
4. Betekenis en toekomstige toepassingen
LSFM is de beste methode beschikbaar zijn tot op heden voor een snelle beeldvorming van grote volumes van levende embryo's. Meeste experimenten denkbaar op een confocale microscoop kan ook worden uitgevoerd op een lichtwaaier microscoop met bovengenoemde voordelen. Bij beeldvorming van oogontwikkeling, de snelheid van LSFM niet de cruciale parameter. In plaats daarvan, de lage fototoxiciteit en de flexibiliteit in de steekproef van de positionering zijn de doorslaggevende voordelen.
De LSFM data een hoge SNR, die helpt om goede resultaten te behalen en deconvolutie is ook gunstig voor automatische beeldanalyse en object tracking. Tot slot, LSFM is een geweldig hulpmiddel voor het genereren van kwantificeerbare gegevens over de embryonale ontwikkeling en Overall cel en kenmerken weefsel voor latere modellering en fysische beschrijvingen van de processen betrokken.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We want to thank Tobias Pietzsch for providing his powerful open source software BigDataViewer. We thank the Light Microscopy Facility of the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG), namely Jan Peychl, Sebastian Bundschuh and Davide Accardi for technical assistance, perfect maintenance of the microscopes used in the study and for comments on the manuscript and H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) for the BigDataServer. We thank Julia Eichhorn for assembling the Movie 1. The Norden lab members and Svea Grieb provided many helpful comments on the manuscript. Jaroslav Icha, Christopher Schmied and Jaydeep Sidhaye are members of the International Max Planck Research School for Cell, Developmental and Systems Biology and doctoral students at TU Dresden. Pavel Tomancak is supported by the ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development and Human Frontier Science Program Young Investigator grant RGY0093/2012. Caren Norden is supported by the Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) and the German Research Foundation (DFG) [SFB 655, A25].
Materials
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Low melting point agarose | Roth | 6351.1 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A4018 or A9414 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine) | Sigma | E10521 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 500 nm red fluorescent beads F-Y 050 | Millipore (Estapor) | 80380495 | |
| 20 μl (1mm inner diameter, marked black) capilllaries | Brand | 701904 | sold as spare part for transferpettor |
| Teflon tip plungers for 20 μl capillaries | Brand | 701932 | sold as spare part for transferpettor |
| Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm | Thermo scientific (Menzel-Glaser) | ||
| O-rings for chamber windows 17×1.5 mm | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Tweezers, style 55 | Dumont | 0209-55-PO | |
| 50 ml Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 300865 | |
| 150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 397400 | |
| Links | |||
| Link 1 Multiview reconstruction application | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction | ||
| Link 2 BigDataViewer | https://github.com/bigdataviewer | ||
| Link 3 BigDataViewer | http://fiji.sc/BigDataViewer | ||
| Link 4 Multiview reconstruction application-issues | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues | ||
| Link 5 BigDataViewer-issues | https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues | ||
| Link 6 BigDataServer | http://fiji.sc/BigDataServer. |
References
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).
- Truong, T. V., Supatto, W. Toward high-content/high-throughput imaging and analysis of embryonic morphogenesis. Genesis. 49 (7), 555-569 (2011).
- Keller, P. J. Imaging Morphogenesis: Technological Advances and Biological Insights. Science. 340 (6137), 1234168-1234168 (2013).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophoton. 6 (11-12), 920-928 (2012).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat Meth. 12 (1), 23-26 (2015).
- Chen, B. C., Legant, W. R., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
- Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy. Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).
- Pampaloni, F., Chang, B. -. J., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues. Cell Tissue Res. 360 (1), 129-141 (2015).
- Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Light sheet microscopy. Quantitative Imaging in Cell Biology. , 193-215 (2014).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141 (11), 2361-2361 (2014).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Maizel, A., von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy. Plant J. 68 (2), 377-385 (2011).
- Swoger, J., Muzzopappa, M., Lòpez-Schier, H., Sharpe, J. 4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies. J Biophoton. 4 (1-2), 122-134 (2010).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Wu, Y., Ghitani, A., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (43), 17708-17713 (2011).
- Sarov, M., Barz, C., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. bioRxiv. , 028308 (2015).
- Amat, F., Lemon, W., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat Meth. 11 (9), 951-958 (2014).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat Meth. 7 (6), 418-419 (2010).
- Preibisch, S., Rohlfing, T., Hasak, M. P., Tomancak, P. Mosaicing of single plane illumination microscopy images using groupwise registration and fast content-based image fusion. SPIEMed Imaging. 6914, 69140E (2008).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Meth. 12 (1), 30-34 (2015).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital Scanned Laser Light-Sheet Fluorescence Microscopy (DSLM) of Zebrafish and Drosophila Embryonic Development. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (10), (2011).
- Pinto-Teixeira, F., Muzzopappa, M., Swoger, J., Mineo, A., Sharpe, J., Lòpez-Schier, H. Intravital imaging of hair-cell development and regeneration in the zebrafish. Front Neuroanat. , (2013).
- Keller, P. J. In vivo imaging of zebrafish embryogenesis. METHODS. , 1-11 (2013).
- Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat Meth. 10 (7), 598-599 (2013).
- Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijò, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat Meth. 10 (7), 599-600 (2013).
- Martinez-Morales, J. R., Rembold, M., et al. ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis. Development. 136 (13), 2165-2175 (2009).
- Strzyz, P. J., Lee, H. O., Sidhaye, J., Weber, I. P., Leung, L. C., Norden, C. Interkinetic Nuclear Migration Is Centrosome Independent and Ensures Apical Cell Division to Maintain Tissue Integrity. Dev Cell. 32 (2), 203-219 (2015).
- Young, L. K., Jarrin, M., Saunter, C. D., Quinlan, R., Girkin, J. M. Using SPIM to track the development of the focal power of the zebrafish lens. SPIE BiOS. 9334, 933408 (2015).
- Preibisch, S., Amat, F., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat Meth. 11 (6), 645-648 (2014).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat Meth. 12 (6), 481-483 (2015).
- Brown, M., Lowe, D. G. Invariant Features from Interest Point Groups. Proceedings of the British Machine Vision Conference. , 23.1-23.10 (2002).
- Saalfeld, S., Fetter, R., Cardona, A., Tomancak, P. Elastic volume reconstruction from series of ultra-thin microscopy sections. Nat Meth. 9 (7), 717-720 (2012).
- Fischler, M. A., Bolles, R. C. Random sample consensus: a paradigm for model fitting with applications to image analysis and automated cartography. Commun ACM. 24 (6), 381-395 (1981).
- Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. -. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1 (1), 2 (2006).
- Stepanova, T., Slemmer, J., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). J Neurosci. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. J Vis Exp. (84), e51119 (2014).
- Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. W., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).
- Ichikawa, T., Nakazato, K., et al. Live imaging and quantitative analysis of gastrulation in mouse embryos using light-sheet microscopy and 3D tracking tools. Nat Protoc. 9 (3), 575-585 (2014).
- Schmied, C., Stamataki, E., Tomancak, P. Open-source solutions for SPIMage processing. Methods Cell Biol. 123, 505-529 (2014).
- Amat, F., Höckendorf, B., Wan, Y., Lemon, W. C., McDole, K., Keller, P. J. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat Protoc. 10 (11), 1679-1696 (2015).
- Schmid, B., Shah, G., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 1-10 (2013).
- Gualda, E. J., Pereira, H., Vale, T., Estrada, M. F., Brito, C., Moreno, N. SPIM-fluid: open source light-sheet based platform for high-throughput imaging. Biomed Opt Express. 6 (11), 4447-4456 (2015).
- McGorty, R., Liu, H., Kamiyama, D., Dong, Z., Guo, S., Huang, B. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt Express. 23 (12), 16142-16153 (2015).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., et al. Spatial and Temporal Features of the Growth of a Bacterial Species Colonizing the Zebrafish Gut. mBio. 5 (6), e01751-14-8 (2014).
