Summary

Administration intra-trachéale de<em> Haemophilus influenzae</em> Dans les modèles de souris pour étudier Airway Inflammation

Published: March 02, 2016
doi:

Summary

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

Abstract

Ici, nous décrivons une procédure détaillée pour efficacement et livrons directement Haemophilus influenzae dans les voies respiratoires inférieures des souris. Nous démontrons la procédure de préparation H. influenzae inoculum, instillation intra-trachéale de H. influenzae dans le poumon, la collecte du liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF), l' analyse des cellules immunitaires dans le BALF et l' isolement de l' ARN pour l' analyse différentielle de l' expression génique. Cette procédure peut être utilisée pour étudier la réponse inflammatoire pulmonaire à une bactérie, un virus ou des champignons. endotrachéale directe instillation est le plus souvent préféré aux procédures d'inhalation par voie nasale ou d'un aérosol, car il fournit plus efficacement l'inoculum bactérien dans les voies respiratoires inférieures avec moins d'ambiguïté.

Introduction

L'inflammation est un mécanisme immunitaire fondamental de la défense contre les agents infectieux. Il favorise l'élimination des agents pathogènes et la réparation des tissus endommagés. Il facilite également la récupération à un état ​​de santé normal 1. Cependant, l' inflammation dérégulée conduit souvent à des maladies inflammatoires chroniques 2. Inflammation des voies respiratoires est un facteur déclenchant diverses maladies pulmonaires telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique (COPD), l' asthme et la fibrose pulmonaire 3.

La non typable (non encapsulé) , Haemophilus influenzae (NTHi) est associée à des maladies inflammatoires pulmonaires supérieures et inférieures à 4,5 chroniques. Ce sont les espèces dominantes isolées des voies respiratoires inférieures des enfants et des adultes avec 4,6,7 chronique de la maladie pulmonaire obstructive. La réponse inflammatoire après l'infection NTHi est caractérisée par la régulation positive des cytokines pro-inflammatoires (telles que le TNF et l'IL-1β), et il est médié by mitogène protéine kinase activée (MAPK) et le facteur nucléaire-kB (NF-kB) grâce à des récepteurs Toll-like (TLR) 8.

Des modèles de souris sont des outils très utiles pour l'analyse de la pathologie sous-jacente de la maladie inflammatoire pulmonaire en raison de la disponibilité des différentes lignes de gènes déficients. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour inoculer des bactéries vivantes atténuées et / produits bactériens, y compris l' instillation intranasale et par inhalation sous forme d' aérosol 9,10. Ici, nous démontrons intra-trachéale instillation. Bien qu'ils soient utilisés moins fréquemment, cette approche est plus efficace et hautement reproductible en raison de la livraison directe de l'inoculum pour les voies respiratoires inférieures.

Protocol

Toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec les directives du Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) de l'Institut de recherche Baylor. 1. La culture non-typable Haemophilus influenzae (NTHi) et préparation de l'inoculum Plaque de NTHi sur une plaque de gélose chocolat et maintenir la plaque à l' envers dans un incubateur à CO2 humidifiée pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2. L…

Representative Results

Instillation intra-trachéale a donné lieu à un nombre nettement accru de leucocytes dans le LLBA (figure 1A, panneau de gauche) que l' installation avec une solution saline. L'analyse de comptage différentiel des leucocytes a clairement montré une infiltration accrue de neutrophiles (Figure 1, panneau de droite). L'analyse FACS des cellules dans le BALF a en outre confirmé l'augmentation du nombre de neutrophiles (figure 1B)…

Discussion

Ici, nous décrivons un procédé unique et peu invasive pour inoculer les poumons de souris par un pathogène bactérien du poumon. Nous démontrons que cette procédure peut être utilisée pour étudier la fonction des différents gènes en utilisant des souris qui sont déficientes en gènes des voies de signalisation inflammatoires. Cette procédure peut également être utilisée pour étudier les réponses inflammatoires à des infections virales et fongiques pulmonaires. Les avantages de cette procédure par rap…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. Carson Harrod for critical reading of the manuscript. We also thank Mr. Minghui Zeng and Drs. Mahesh Kathania and Prashant Khare for their contributions. This work was supported by grants from the American Cancer Society (Research Scholar grant, 122713-RSG-12-260-01-LIB) and the Sammons Cancer Center (Pilot Project grant) to K. Venuprasad.

Materials

Chocolate agar plate Fisher Scientific CAS50-99-7
Dextrose Anhydrous Themo Scientific R01300
Heparin Hospira,Inc RL-3010
Deft quick solution Sigma GS500-500ML
Syringe needle 20/26G  BD (REF305115/175)
Iml syringe BD REF 309602
Catheter 20GA BD REF 381433
Dissecting Scissors, straight, 10 cm long kentscientific INS600393
Iris Forceps, serrated, 10cm long kentscientific INS650915
Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long kentscientific INS600095
10% Formalin Fisher Scientific CAS 67-56-1
Agarose peqlab 35-1020
5ml polystyrene round-bottom tubes BD REF 352058
1.5 ml Microcentrifuge tubes Light Labs A-7001-R
Reasy Mini  kit  Qiagen 74104
Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) Sigma Z359971-1EA
96 well microtiter plates V bottom Thermo 2605
1X PBS Gibco 10010-023
OneComp eBeads eBioscience 01-1111-42
CD45.2-APC eBioscience 17-0454-81 Working dilution 1:100
Ly-6G-eFlor 450 eBioscience 48-5931-82 Working dilution 1:100
BSA HyClone SH30574.03
RBC Lysis Buffer (10X) Biolegend 420301
Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit Invitrogen L-34957
EDTA (0.5M) lifetechnologies 15575-020
CD16/CD32 FcBlock BD 553142
Facs tubes polystyrene round bottom tube BD 352052
Formaldehyde Polyscience 4018

References

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Cite This Article
Venuprasad, K., Theivanthiran, B., Cantarel, B. Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation. J. Vis. Exp. (109), e53964, doi:10.3791/53964 (2016).

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