Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.
Somatosensoriyel sinirler termal, mekanik, kimyasal, hem endojen ve çevresel faktörlerden oluşan zararlı uyaranlara transduce. Bu afferent nöronların hücre gövdeleri duyusal ganglionlar içinde yer almaktadır. Duyu ganglion vücudun belirli bir organ veya bir kısmını innerve. Örneğin, dorsal kök gangliyon (DRG) Vertebral kolon bulunan ve vücutta ve bacaklarda boyunca süreçleri uzatmak. trigeminal ganglion kafatası bulunan ve yüz innerve ve üst solunum yolları vardır. boğumlu ganglionlar vagal afferentler bağırsak, kalp, akciğerler ve boyunca uzanır. solunum hızı, solunum yolu tahrişi ve öksürük reflekslerinin: boğumlu nöronlar gibi fonksiyonların çeşitli bir dizi kontrol eder. Bu durumda, anlaşılması ve işlevini değiştirmek için, hava yolu spesifik nöronal alt popülasyonlarının belirlenmesi ve izole edilmesi için çok önemlidir. Fare, hava yolları havayolu özgü boğumlu nöronun retrograd takibi için bir floresan tracer boya, Hızlı Mavi, maruzs. nodoz gangliyon parçalanır ve flöresanla aktive edilen hücre (FAC) ayırma boyası pozitif hücrelerin toplanması için kullanılır. Daha sonra, yüksek kaliteli ribonükleik asit (RNA) yeni nesil dizileme için boya pozitif hücreler elde edilir. spesifik nöronal gen ifadesi belirlenir bu yöntem havayolunu kullanarak.
Somatosensoriyel sinirler termal, mekanik, kimyasal, hem endojen ve çevresel faktörlerden oluşan zararlı uyaranlara transduce. Bu afferent sinirlerin hücre gövdeleri arka kök, trigeminal veya nodoz gangliyon olarak, duyusal ganglia yer almaktadır. Her duyu ganglion vücudun belirli bölgeleri innervates ve o bölgedeki ayrı organ ve dokuları innerve hücreler içerir. Örneğin, dorsal kök gangliyon (DRG) Vertebral kolon bulunan ve trigeminal ganglion kafatası yer alırken hava yolları 1 üst yüz, gözler, meninksler veya innerve nöron içeren, gövde ve uzuvların boyunca süreçleri uzatmak, 2. Vagus sinirinin boğumlu ganglion alt solunum yolları ve akciğerleri 3 kafatası altındaki boyunda bulunan ve gastrointestinal sistem, kalp boyunca sinir liflerini uzatmak hücre gövdeleri içerir ve. İnsanlarda boğumlu ganglion, ancak fare birleştirildiği, tek başına duruyorAyrıca akciğerleri 4 innervates juguler gangliyon ile. Bu erimiş ganglion genellikle / juguler boğumlu karmaşık, vagus ganglion denilen, ya da sadece boğumlu ganglion 5 edilir. Burada, boğumlu gangliyon olarak adlandırılır.
boğumlu afferent lifler beyin sapındaki yalnız yolu (NTS) çekirdeğine iç organlardan gelen bilgi aktarmak. Bu eşsiz ganglion duyusal girdi böyle gut hareketindeki 6, kalp hızı 7, solunum 8,9 ve tahriş aktive solunum tepkiler 10,11 gibi işlevleri, çeşitli bir dizi kontrol eder. fonksiyonları ve innerve organların bu çeşitliliği sayesinde, hedef ve bireysel nöronal yolları araştırmak için boğumlu ganglion organ spesifik alt popülasyonlar ayırmak için kritik öneme sahiptir. Ancak, boğumlu küçük boyutu ve bu önemsiz bir görev değildir içeren nöronların sınırlı sayıda verilen. Ganglion nodoz Her fare yaklaşık 5.000 nöronlar 12 içerirUydu hücreleri destekleyici geniş bir nüfusa ek olarak. % 5 innervate solunum yollarında – 5000 boğumlu nöronlar, sadece 3. Dolayısıyla, solunum uyarılması veya patolojilere havayolu-innerve nöronların içinde herhangi bir fonksiyonel morfolojik veya moleküler değişiklikler, yoğun dolu boğumlu ganglion kaybolur.
Bu sorunu çözmek için, bir yöntem belirlemek ve hava yollarını innerve nöronlar izole etmek için geliştirilmiştir. üst solunum yolları takip eden innerve nodoz nöronların tespit etmek, bir floresanlı işaretleyici boya maruz bırakılmıştır. Hızlı Mavi nöronlar tarafından yakalandı ve en fazla sekiz hafta 13 korunur hücre gövdeleri hızla yolculuk oldu – 15. Bir kez nazik, henüz etkili, ayrışma protokol floresan aktif hücre (FAC) sıralamak için boya etiketleme ve hücre canlılığını korumak için kullanılan belirlendi. Kriteri hücrelerinin gen ekspresyonunu veya f belirlemek için, yüksek kaliteli ribonükleik asit (RNA) elde etmek için kullanılırveya diğer alt moleküler analizi. Bu protokol, ilgi konusu bir dokuda innerve duyusal nöronlar izole etmek için kullanışlı ve güçlü bir teknik sağlamaktadır.
Bu protokol, vagus sinirinin nodoz ganglionlarda hava yolu innerve nöronların hedeflemek için bir yöntemi anlatmaktadır. Bir kez etiketlenmiş, ganglionlar yavaşça optimum hücre sayıları ve canlılığı korumak için ayrışmış. Bu nöronlar FAC lizis tamponu doğrudan sıralanır ve RNA ayıklanır daha sonra. Bu protokolün önemi, hedef izole ve belirli duyusal hücre popülasyonunun kalitesini korumak için yeteneğidir. Gen ekspresyonu nöronların bu küçük nüfus anlatılan ve organa özel fonksiyo…
The authors have nothing to disclose.
NIH tarafından desteklenen sej için R01HL105635 verin. Yazarlar teknik danışmanlık için Diego V. Bohórquez teşekkür etmek istiyorum. Biz de teknik yardım için R. Ian Cumming teşekkür ve Duke İnsan Aşı Enstitüsü Araştırma Sitometrisi Paylaşımlı Kaynak Tesisi (Durham, NC) flow sitometri gerçekleştirmek. sitometri Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (adet UC6-AI058607) dan yapımı için kısmi destek aldı Duke Bölgesel biyosınırlılık Laboratuarında gerçekleştirilmiştir Akış.
Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
N2 | Gibco | 17502-048 | |
B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
Heating block | LabNet | ||
70 um cell strainer | Falcon | 352350 | |
Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |