Studiare Wnt segnalazione Durante Patterning di condurre Airways
Summary
L'uso di topi reporter accoppiati a tutto il monte e sezione colorazione, microscopia e in vivo facilita l'analisi dei meccanismi alla base della normale patterning del tratto respiratorio. Qui si descrive come queste tecniche hanno contribuito all'analisi di segnalazione Wnt durante lo sviluppo tracheale.
Abstract
Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.
Introduction
Lo sviluppo delle vie respiratorie è avviata da embrionali giorno 9 (E9) con la comparsa di cellule positive Nkx2.1 nel endodermico ventrale foregut 1,2. Esofago-tracheale separazione tubo si risolverà da E11.5 quando i tubi possono essere distinte come entità distinte, ognuna circondata dal tessuto mesenchimale 3. Wnt svolge un ruolo chiave nella specifica delle vie respiratorie come l'eliminazione di Wnt2 e Wnt2b, espressa dal mesenchima splancnico e la cancellazione di β-catenina dal epitelio respiratorio endodermico si tradurrà in agenesia del polmone 4,5. I nostri studi precedenti hanno stabilito che la cancellazione di WLS, un recettore carico mediazione secrezione di tutti i ligandi Wnt, dai risultati del tratto respiratorio endodermico a ipoplasia polmonare, difetti di sviluppo vascolare polmonare e mis-patterning del tracheale mesenchima 6,7. Questi dati supportano l'importanza del cro epitelio-mesenchimaless parlare nel differenziamento cellulare e specifica, come è stato mostrato anche in altri studi 8,9.
Lo studio delle prime fasi di sviluppo del polmone si basa su genetica, in vitro ed ex vivo tecniche che hanno permesso di comprendere meglio i meccanismi di guida identità respiratoria 10-16. Intere culture espianto polmone all'interfase liquido dell'aria sono stati ampiamente utilizzati per studiare gli effetti di fattori di crescita nelle prime fasi di polmonare branching morfogenesi 10,17,18. Mentre questo metodo è usato come lettura dei cambiamenti morfologici, come morfogenesi di ramificazione, e la modulazione dell'espressione genica, è limitato allo studio delle prime fasi del processo di sviluppo, la cultura stessa non supporta lo sviluppo di vascolarizzazione 17. Sviluppo di tracheale cartilagine richiede tempi di incubazione più lunghi che possono essere non compatibili con questa tecnica di coltura.
per Analyze il ruolo di segnalazione Wnt durante la formazione del tratto respiratorio, abbiamo adattato le tecniche standard per soddisfare le esigenze dei nostri studi embrionali. Abbiamo modificato i volumi, i tempi di colorazione, trattamento ciclismo per paraffina e la tempistica per la compensazione del tessuto tracheale-polmonare. L'obiettivo principale di ottimizzare le tecniche descritte nel presente studio è stato quello di analizzare le prime fasi di sviluppo tracheale nei topi che si svolgono da E11 a E14.5. Utilizzando il topo giornalista linea Axin2LacZ noi siti precisamente determinati di attività / β-catenina Wnt in via di sviluppo mesenchima tracheale. Abbiamo anche adattato procedura di colorazione lectina per tutto il tessuto tracheale monte. Così, siamo stati in grado di visualizzare condensazioni mesenchimali e prevedere siti dove chondrogenesis avrà luogo. La colorazione di tutto il monte e sezioni di tessuto embrionale ottenuti da topi WlsShhCre, insieme con tecniche di microscopia avanzate, ci ha permesso di svelare il ruolo di ligandi Wnt prodotte dal TRAepitelio endotracheale nella trachea patterning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eventi sottostanti morfogenesi del tratto respiratorio sono state comprese, in particolare i processi necessari per il patterning delle vie aeree di conduzione. Studi precedenti hanno utilizzato ex vivo le tecniche di cui espianti in via di sviluppo sono coltivate all'interfase aria-liquido o incorporato in matrigel 21,22. Questi studi hanno dimostrato come fattori di crescita influenzano il patterning della trachea sviluppo e la formazione di tracheale cartilagine. Una limitazione a questi studi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo l'assistenza di Mike Muntifering e Matt Kofron con confocale e Gail Macke con procedure istologiche. Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 per DS).
Materials
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
| Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
| PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
| Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
| Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
| Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro knives | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
| NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10x. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
| Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
| Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
| NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
| IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |
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