Rolü seğirmesi Motilitesi görselleştirme ve Karakterizasyonu<em> PilG</em> 'de<em> Xylella fastidiosa</em
Summary
Bu çalışmada, nano-mikroakışkan akış odası görselleştirmek ve işlevsel Xylella fastidiosa, dedikodu olarak Pierce hastalığa neden olan bir bakterinin seğirmesi motilitesini karakterize etmek kullanılmıştır.
Abstract
Xylella fastidiosa bitkiler ekonomik açıdan önemli hastalıklara neden olan bir dizi, bir Gram-negatif olmayan kamçılı bir bakteridir. Seğirmesi motilitesi X sağlar fastidiosa uzun mesafe içi bitki hareketi ve kolonizasyonu için bir araç X patojenik doğru katkıda X'in fastidiosa. seğirmesi motilite fastidiosa tip IV pili tarafından işletilmektedir. Xylella fastidiosa ve Tip IV pili pilG, sinyal transdüksiyon geçiş yolları ile ilişkili olan Pil-Chp operon'u şifreleyen proteinler bir kemotaksis regülatörü tarafından düzenlenir. X'in seğirmesi motilitesinde pilG rollerini aydınlatmak için fastidiosa, bir pilG -açıklı mutant Xf ΔpilG ve yerli pilG içeren tamamlayıcı suşu XfΔpilG- C geliştirilmiştir. Time-lapse görüntü kayıt sistemi ile entegre bir mikroakışkan odaları XfΔp içinde seğirmesi hareketliliğini gözlemlemek için kullanılanILG, XfΔpilG- C ve vahşi tip süzün. Bu kayıt sistemi kullanarak, uzun vadeli mekansal ve zamansal toplama gözlemlerini, tek tek hücrelerin ve seğirmesi hareketlilik yoluyla bakteri popülasyonlarının göç izin verir. X Mutant XfΔpliG seğirmesi eksik fenotip sergilenen oysa fastidiosa yabani tip ve tamamlayıcı XfΔpilG- C suşu, doğrudan mikroakışkan akış gözlerinden gözlenen tipik seğirmesi motilite özellikleri gösterdi. Bu çalışma pilG X. seğirmesi hareketliliğin artmasını göstermektedir fastidiosa. mikroakışkan akış odası seğirmesi hareketliliği gözlemlemek için bir araç olarak kullanılmaktadır.
Introduction
Xylella fastidiosa Grapevine Pierce hastalığı (Vitis vinifera L.), 1,2, 3 dahil olmak üzere ekonomik olarak önemli bitkisel hastalıkların bir dizi neden olan bir Gram-negatif olmayan kamçılı, patojen bir bakteridir. Bu bakteri su ileten ksilem sınırlıdır gemiler. Asmanın Enfeksiyon ksilem gemi ve su stresi sonuçları ve beslenme yetersizlikleri 3 tıkanmasına neden olur. Başarılı kolonizasyon tesisi 3 geri kalanına enfeksiyon ilk siteden taşımak için bakterinin yeteneğine bağlıdır. X özelliği olan polar tip IV Pili 4 uzatılması, bağlanma ve geri çekme yoluyla flagellar bağımsız bakteriyel hareketi için bir araç motilitesini olan seğirmesi fastidiosa 5,6,7.
Seğirmesi motilite lazer cımbız ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) 8,9,10 tarafından gözlenmiştir. Bu teknikler kullanılarak, twitching motiliteler N. tip IV pilus tarafından oluşturulan gonorrhoeae ve S. aeruginosa fl uorescently etiketleme pili ve mikroskopik hareketlerini yakalayarak ile karakterize edildi. Her iki yöntem bireysel bakterilerin yapışkan kuvveti ayrıntılı olmasına rağmen, prosedürler karmaşık ve zaman 9,10 alıcıdır. Mikro fl uidic odalar uzun mesafe, tek tek hücrelerin göçünü ve bakteri hücreleri 5,6 küçük agregalar gözlemlemek için kullanılmıştır. Bu odalar bir time-lapse görüntü kayıt sistemi 11,12,13,14 ile entegre bir tabak içinde bir microfabricated-nano-kanal olarak dizayn edilmiştir. Mikro uidic odacık cihazlar bakteri hareketi davranışı ve hücre-hücre etkileşimleri incelemek için çeşitli avantajlar sunar fl: (i) bir çok kanallı yetenekleri ile entegre bir platform sağlar; (Ii) hareketler ve bakteri nano ölçekli özellikleri tek hücre toplamlar inceleyebilirsiniz; (Iii) doğrudan m sağlarbakteriyel hücrelerin ve zaman atlamalı analizi icroscopic görüntü kaydı, (iv) bir mikro-ortamda bakterilerin tek tek ve / veya popülasyonlarının uzun süreli mekansal ve zamansal gözlemler sağlar; (V) bir kanalda kültür ortamının akış hızı hassas bir şekilde kontrol edilebilir ve kültür ortamında (vi) sadece çok küçük bir hacmi (1 mi), her bir deney için gereklidir.
Son zamanlarda, mikro fl uidic akış sistemi çeşitli mikroçevrelerde 14,15,16 altında bakteri hücrelerinin davranışlarını araştırmak için istihdam edilmiştir. Yapışkanlık ve E. yüzey eki E. coli, 15 X fastidiosa 16 ve Acidovorax cam yüzeylere 14 mikro fl uidic odaları kullanılarak değerlendirildi citrulli. Acidovorax citrulli tipi IV pili aracılığıyla toplama ve biyo fi lm oluşumu 14 analiz edildi. A. Ayrıca, hareket citrulli akış c altında gözlenenşartlarından Tip IV pili kolonizasyon önemli roller oynayabileceğini göstermiştir ve A. yayıldı sap akış koşulları altında ksilem damarlarında citrulli. Pseudomonas aeruginosa ve X'in seğirmesi motiliteler fastidiosa hücreleri başarılı bir şekilde mikrofabrike akış odasının 5,6,17 bir akışkan akımına karşı gözlendi. Tip IV pilus X. pilB ve pilQ mutantlar yoksun fastidiosa derinden mikro fl uidic cihazlar 5,6,18 içinde akış koşulları altında motilite seğirmesi hızını değiştirmek için bulunmuştur. Mikro fl uidic cihazlarda bakteri yapışma ve motilitesi üzerinde yapılan çalışmalar, mikro fl uidic odaları in vitro pili aracılı bakterilerin seğirmesi motilitesini ve göç analizi için özellikle uygun olduğunu göstermiştir. Bu sonuçlar hücre-hücre eki, agregasyonu ve kolonizasyonu içinde kolaylaştırır seğirmesi aracılı göç mekanizmasını açıklamakEv sahibi, sonuçta sistemik enfeksiyona yol.
X. Pil-Chp operon fastidiosa kodlamak sinyal iletimi 20 yolaklarıyla pilG, pili, pilJ, hap, chpB ve chpC içerir. transmembran kemoreseptörlerin periplazmik etki kimyasal uyaranlara bağlamak ve sonuçta bakteriyel seğirmesi hareketliliğini kontrol etme sitoplazmik kısmı bir sinyal kaskad etkinleştirin. X'in Pil-Chp operonunda fastidiosa, fosfo-geçiş proteini PilG Chey bir homologudur. E. E. coli ve P. aeruginosa, Chey kamçı motor proteinlerin 19, 21 ile etkileşim kemotaksis sistemlerinde yanıt düzenleyicisidir. X'de virülansına doğru Pil-Chp operon katkıları olmasına rağmen fastidiosa çevresel sinyallere yanıt olarak ve X'in ayarlı / motor tip IV Pili için, en son kemotaksis operonunda pilG rolü 20 incelenmiştir fastidiosa unc olduğunulear. X'in seğirmesi hareketlilik aktivitesindeki kemotaksis regülatör pilG bir fikir aydınlatmak için fastidiosa, mikro fl uidic odası X'in seğirmesi motilitesini değerlendirmek için kullanılır fastidiosa. X fastidiosa ve pilG bir silme mutantı Xf ΔpliG tamamlayıcı suşu XfΔpliG C ve in vitro olarak vahşi tip fenotipleri karşılaştırılması ile karakterize edilir. Sonuçlar X'in seğirmesi motilite pilG rolünü vurgulamak fastidiosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, biz X'in hareket davranışını karakterize fastidiosa PilG mutant Xf ΔpilG ve yeni tasarlanmış çoklu paralel nano-kanal mikro fl uidic odalarında tamamlayıcı XfΔpilG- C suşları. Yeni tasarlanan mikro fl uidic odaları tek bir 50 mikron genişliğinde kanal 18 ile daha önceki tasarımlara göre genişliği 100 mikron nano-kanal ile en fazla dört paralel odaları olabilir. geliştirilmiş geniş nano-kanal medyanın akan ba…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma ABD Tarım Dairesi, Tarımsal Araştırma Servisi tarafından desteklenmiştir. Bu yayındaki ticari adlar veya ticari ürünler belirli bilgi vermek amacıyla sadece belirtilen ve ABD Tarım Bakanlığı tarafından tavsiye veya onaylandığı anlamına gelmez. USDA bir fırsat eşitliği sağlayıcı ve işverendir.
Materials
| Biology materials | |||
| X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type | Costa, H. S., et al., 2004 22 | ||
| pilG deletion mutant XfΔpliG | Shi, X. Y., et al., 2007 26 | ||
| pilG complementary strain XfΔpliG-C | Davis, M. J., wt al. 1998 23 | ||
| Physical materials and equipment | |||
| Disposable inoculating loops | VWR international, Radnor, PA | #22-363-607 | quantitative procedures such as bacterial collection |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | #0002709226 | Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits |
| AmScope MD2000 digital camera | AmScope, Irvine, CA | SE305R-AZ-E | Image, video recording and measurement |
| Tubes line | Edgewood, NY | #T4300 | Connected to the syringe and microfluidic chamber |
| Plastic luer connectors | Edgewood, NY | Connected to the syringe and microfluidic chamber | |
| Syringe pumps | Pico Plus, Harvard Apparatus, MA | #702209 | The flow rate can be adjusted while the pump is running. |
| Syringes | Gastight, Hemilton Company, Reno, NV | #1005 | Provide the flowing broth |
| Inverted Olympus IMT-2 microscope | Olympus | IMT-2 FLuoro PHase | Image observation and recording |
| SPOT-RT digital camera | Diagnostic Instruments, Inc., MI | RT230 | Image, video recording and measurement |
| Microscope Shutter | The UNIBLITZ, US | #LS2T2 | Control camera’s exposure time |
| Microscope Shutter Control system | The UNIBLITZ, US | VCM-D1 | VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver |
| MetaMorph Image software | Universal Imaging Corp., PA | Real-time super-resolution image processing |
References
- Purcell, A. H., Hopkins, D. L. Fastidious xylem-limited bacterial plant pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 34, 131-151 (1996).
- Purcell, A. H. Xylella fastidiosa, a regional problem or global threat. J. Plant Pathology. 79, 99-105 (1997).
- Hopkins, D. L. Xylella fastidiosa: Xylem-limited bacterial pathogen of plants. Annu. Rev. Phytopathol. 27, 271-290 (1989).
- Mattick, J. S. Type IV pili and twitching motility. Annu. Rev. Microbiol. 56, 289-314 (2002).
- Meng, Y., et al. Upstream migration of Xylella fastidiosa via pilus-driven twitching motility. J. Bacteriol. 187, 5560-5567 (2005).
- Li, Y., et al. Type I and type IV pili of Xylella fastidiosa affect twitching motility, biofilm formation and cell-cell aggregation. Microbiology. 153, 719-726 (2007).
- Simpson, A. J. G., et al. The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa. Nature. 406, 151-157 (2000).
- Maier, B., Potter, L., So, M., Long, C. D., Seifert, H. S., Sheetz, M. P. Single pilus motor forces exceed 100 pN. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16012-16017 (2002).
- Touhami, A., Jericho, M. H., Boyd, J. M., Beveridge, T. J. Nanoscale characterization and determination of adhesion forces of Pseudomonas aeruginosa pili by using atomic force microscopy. J. Bacteriol. 188, 370-377 (2006).
- Skerker, J. M., Berg, H. C. Direct observation of extension and retraction of type IV pili. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6901-6904 (2001).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9 (2001).
- Thomas, W. E., Nilsson, L. M., Forero, M., Sokurenko, E. V., Vogel, V. Shear-dependent ‘stick-and-roll’ adhesion of type 1 fimbriated Escherichia coli. Mol. Microbiol. 53, 1545-1557 (2004).
- Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force. Cell. 109, 913-923 (2002).
- Bahar, O., Fuente, D. L., Burdman, S. Assessing adhesion, biofilm formation and motility of Acidovorax citrulli using microfluidic flow chambers. FEMS Microbiol. Lett. 312, 33-39 (2010).
- Thomas, W. E. Using a laminar flow system to explain shear-enhanced bacterial adhesion. Proceedings of ICMM2005, Third International Conference on Microchannels and Mini-channels. , 751-759 (2005).
- Fuente, D. L., et al. Assessing adhesion forces of type I and type IV pili of Xylella fastidiosa bacteria by use of a microfluidic flow chamber. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2690-2696 (2007).
- DeLange, P. A., Collins, T. L., Pierce, G. E., Robinson, J. B. PilJ localizes to cell poles and is required for type IV pilus extension in Pseudomonas aeruginosa. Curr Microbiol. 55, 389-395 (2007).
- Fuente, D. L., Burr, T. J., Hoch, H. C. Mutations in type I and type IV pilus biosynthetic genes affect twitching motility rates in Xylella fastidiosa. J. Bacteriol. 189, 7507-7510 (2007).
- Ferandez, A., Hawkins, A. C., Summerfield, D. T., Harwood, C. S. Cluster II che genes from Pseudomonas aeruginosa are required for an optimal chemotactic response. J. Bacteriol. 184, 4374-4383 (2002).
- Cursino, L., et al. Identification of an Operon, Pil-Chp, That Controls Twitching Motility and Virulence in Xylella fastidiosa. Mol. Plant Microbe Interact. 10, 1198-1206 (2011).
- Hazelbauer, G. L., Falke, J. J., Parkinson, J. S. Bacterial chemoreceptors: High-performance signaling in networked arrays. Trends Biochem. Sci. 33, 9-19 (2008).
- Costa, H. S., et al. Plant hosts of Xylella fastidiosa in and near southern California vineyards. Plant Dis. 88, 1255-1261 (2004).
- Shi, X. Y., Dumenyo, C. K., Hernandez-Martinez, R., Azad, H., Cooksey, D. A. Characterization of regulatory pathways in Xylella fastidiosa: genes and phenotypes controlled by algU. Appl. Environ. Microbiol. 73, 6748-6756 (2007).
- Matsumoto, A., Young, G. M., Igo, M. M. Chromosome-Based Genetic Complementation System for Xylella fastidiosa. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1679-1687 (2009).
- Davis, M. J., Purcell, A. H., Thomson, S. V. Isolation Media for the Pierce’s Disease Bacterium. Phytopathology. 70, 425-429 (1980).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annu. Rev. Mater. Sci. 28, 153-184 (1998).
- Chaudhury, M. K., Whitesides, G. M. Direct measurement of interfacial interactions between semispherical lenses and flat sheets of poly-(dimethylsiloxane) and their chemical derivatives. Langmuir. 7, 1013-1025 (1991).
- Cruz, L. F., Parker, J. K., Cobine, P. A., De La Fuente, L. Calcium-enhanced twitching motility in Xylella fastidiosa is linked to a single PilY1 homolog. Appl. Environ. Microbiol. 80, 7176-7196 (2014).
