Aufrechterhaltung eines<em> Drosophila melanogaster</em> Bevölkerung Cage
Summary
This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.
Abstract
Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.
Introduction
Die Fähigkeit , genetische und biochemische Ansätze zu kombinieren , hat Drosophila einen besonders geeigneten Organismus für Biochemie und Molekularbiologie Studien 1-3. Diese Studien erfordern oft große Mengen an biologischem Material, nicht nur von erwachsenen Fliegen, sondern auch von Larven 4, 5 und pupae Embryonen 6-8. Zur Gewinnung großer Mengen von Material, haben Forscher kultivierten Fliegen mit großen Behältern bekannt als fliegen "Bevölkerung Käfige". Diese Käfige bestehen aus einem Zylinder aus Kunststoff mit einem Netz auf beiden Seiten überzogen ist, die Einführung des Lebensmittels im Inneren des Käfigs zu ermöglichen, ohne das entweichende Fliegen. Diese Käfige können von einem Unternehmen selbst gemachte 9-11 oder gekauft werden (siehe Tabelle der spezifischen Materialien / Ausrüstung).
Ein großer Vorteil dieses System der Verwendung einer großen Anzahl von Fliegen zu wachsen , ist , dass der Zyklus der Frucht 12 in einer Weise gesteuert werden kann fliegen , die alle Fliegen in einem Wieder entwickelnlativ synchronisiert. Diese Synchronisation wird durch Impfen neue Embryonen erreicht, Fütterung Larven / Fliegen und die erwachsenen Fliegen in genauen Zeiten zu opfern. Eine synchronisierte Fliegenpopulation unter Verwendung ist besonders nützlich für Entwicklungsstudien 13.
Der Beginn einer neuen Population Käfig von einigen Fliegen ist ein zeitraubender Vorgang erfordert viele Amplifikationszyklen 9-11. mit größeren Behältern wie Fliegenkulturflaschen oder minicages Auch kann der gesamte Prozess für Monate dauern. Aufwendige Arbeitsschritt pflegen viele Drosophila Laboratorien regelmäßig solche Käfige Um diese Zeit zu vermeiden. Es ist sehr bequem, einen neuen Käfig aus einem Embryo Sammlung von einem bereits etablierten Bevölkerung Käfig beginnen zu starten. In der Regel halten die meisten Labors Wildtyp- Bevölkerung Käfigen, wie Oregon R oder Kanton S. Dieses Manuskript enthält eine detaillierte Protokoll Fliegenpopulation Käfigen zu halten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ausgehend von 1,5 g des Materials kann man eine Ausbeute von gesammelten Embryos zwischen 7 und 13 g pro Zyklus erhalten. Um eine solche Menge an Material, ist es entscheidend, die richtige Züchtungsbedingungen für alle Phasen der Flugzyklus aufrechtzuerhalten.
Die wichtigsten Parameter sind die Temperatur und die Feuchtigkeit, die jeweils 24 ºC und 35% liegen. Wenn diese beiden Parameter nicht konstant gehalten werden in der normalen Umgebung des Labors, wäre eine Möglichkeit, den Flugkäfig in einen Inkubator oder einer Klimakammer zu platzieren. Andere Protokolle empfehlen 70% Luftfeuchtigkeit und auch eine konstante 24 Stunden Licht-Dunkel – Zyklus , die Ausbeute der produzierten Eier 9,10 zu erhöhen. Allerdings halten vermeidet die Feuchtigkeit um 35% bakterielle Kontamination, und da der Zweck dieses Protokolls nur die Aufrechterhaltung einer Bevölkerung Käfig ist, werden die Fliegen in der normalen Licht Umgebung des Labors gehalten.
Ein weiterer wichtiger Punkt ist, di zu haltensturbances dem Erwachsenen fliegt so niedrig wie möglich. Es kann ratsam sein, den Käfig in einer Position getrennt von der Fliegenraum zu halten, um Kreuzkontamination von anderen entfernt zu vermeiden.
Die Züchtung von großen Populationen von transgenen und mutierten Fliegen wird nicht empfohlen, da es sehr schwierig ist , ihre Reinheit zu erhalten , und sie können in großen Bevölkerungs Käfige 14 ausgeprägte abnormal Paarungsverhalten aufweisen.
Ein mögliches Problem bei der Drosophila Kultivierung in großen Mengen ist das Vorhandensein von anderen Organismen wie Milben und / oder Form, die für die Lebensmittel konkurrieren und damit die Ausbeute der produzierten Eier zu reduzieren. Um dies zu vermeiden, ist es sehr wichtig, alle Geräte sauber zu halten, Waschen Sie den Käfig, Netze und Fliegenboxen mit Wasser und Seife, und Verwerfen des Einwegmaterial (Schaumstöpsel) nach jedem Zyklus. Zur Verringerung der Schimmel wächst, Propionsäure und Phosphorsäure in die nasse Hefe hinzugefügt, wenn die Fliege Essen in Schritt Vorbereitung1.2 und Tegosept wenn die Melasse Tablett 3.1 in Schritt vorbereitet. Es ist manchmal hilfreich, um Platz Materialien wie die Kunststoff-Box oder Siebe in -20 ° C, wenn die Zeit knapp ist und Materialien können nicht sofort gereinigt werden.
Eine ganze Sammlung Zyklus tritt in 14 – 15 Tagen beginnen, wenn die Embryonen in die Fliegenkasten ausgesät werden und mit der letzten Sammlung Tag endet. Während dieser Zeit ist es empfehlenswert , einen Zeitplan zu organisieren , um alle notwendigen Schritte für die Erhaltung einer Population Fliegen Käfig zu erinnern (Abb. 2), detailliert im Abschnitt Protokoll. Von dem Tag an, dass die Eier werden ausgesät, bis die erwachsenen Fliegen entstehen, ist es notwendig, nur die Kunststoff-Box zu kontrollieren, und wenn der Verpuppung erfolgt, so dass sie in den Käfig zu setzen. Danach müssen die Fliegen alle 2 gefüttert – 3 Tage bis Embryonen für einen neuen Zyklus ausgesät werden. In der gesamten Protokoll ist der längste Tag während des Sammelns und Aussaat der Embryonen für einen neuen Zyklus zu starten. EINs im Protokoll kommentiert, ist die beste Ei Ertrag 3 – 5 Tage nach dem Schlüpfen Erwachsenen und schließlich sinkt 2 Tage später. Das gibt uns eine gewisse Flexibilität, um den Tag, an dem die Ernte der Eier durchgeführt werden, um zu wählen.
Wenn aus irgendeinem Grund ist die Ausbeute an gesammelten Embryonen weniger als die gewünschte Ausgangsbetrag (1,5 g), immer kann man eine neue Melasse Tablett hinzuzufügen und mehr Eier am nächsten Tag zu sammeln. Für konstante Sammlungen, wird empfohlen, 2 Käfige in parallel zu halten und, wenn höhere Mengen an Embryonen erforderlich sind, ist es auch möglich, größere Käfige zu verwenden. Bei kurzer Zeit Sammlungen zu tun, ist eine Möglichkeit, um die Ausbeute zu erhöhen Vorteil der Eiablage Burst am Morgen zu nehmen.
Es gibt viele Vorteile von großen Mengen von verschiedenen Entwicklungsstadien zu sammeln. Zum Beispiel gesammelt Embryonen aus Bevölkerung Käfigen wurden sehr erfolgreich in Immunpräzipitationstests 6-8, Masse collectio verwendetn der Larvengewebe von dissoziierten Larven hat gezeigt , 15 eine sehr gute Quelle für 3C Experimente 4 und RNA – Präparationen zu sein, und Köpfe von erwachsenen Fliegen wurden für ChIP Experimente 16 verwendet. Zusätzlich werden Erwachsenen häufig benötigt fly Extrakte für die Gewebekultur 17 zu machen.
Eine der vielversprechendsten Anwendungen der Käfig Material für Hochdurchsatz-Assays zur Verfügung zu stellen, die die Analyse und das Screening von Genen, Transkripten, Proteinen und Stoffwechselprodukten in Reaktion auf die Exposition von Pathogenen, biologischen Molekülen, chemischen Substanzen und ionisierender Strahlung ermöglichen. In diesen großen Assays eine große Anzahl von Personen erforderlich sind, und der Käfig Fliegenpopulation beschrieben hier kann sehr hilfreich sein , um große Mengen des Materials 18 während der verschiedenen Phasen des Drosophila – Lebenszyklus für ihre Analyse und Screening zu erhalten.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Yixian Zheng (Carnegie Institution of Washington, Baltimore, MD) for the original protocol and assistance in initial setup and members of the Lei laboratory for critical reading of the manuscript. This work was funded by the Intramural Research Program of the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.
Materials
| Bacto-Agar | Beckton Dickinson | 214010 | |
| Curity practical cotton roll | Kendall | 2287 | |
| Dry yeast | Affymetrix | 23540 | |
| Filter paper | GE Healthcare Life Science | 1001-085 | |
| Foam tube plugs | Jaece | L800-D2 | 50 mm Diameter x 55 mm Length |
| Fly population cage | Flystuff | 59-116 | 9″ Diameter x 14.4″ Length. Includes the nets for the cage. |
| Meat tray | Genpak | 1002S (#2S) | 8.25 x 5.75 x 0.5 inches |
| Molasses | Grandma´s | ||
| Plastic container | Rubbermaid | 4022-00 | |
| Plastic film | Glad | ||
| Phosphoric acid | Fisher Scientific | S 93326 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A258-500 | Toxic. Handle in Chemistry Hood |
| Stainless steel sieve #100 | VWR | 57324-400 | |
| Stainless steel sieve #40 | VWR | 57324-272 | |
| Stainless steel sieve #30 | VWR | 57324-240 | |
| Sucrose | MP | 152584 | |
| Tegasept | LabScientific | FLY5501 | |
| Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
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